基于Akt/eNOS通路探讨延胡索乙素对缺氧/复氧诱导的心脏微血管内皮细胞损伤的保护作用

马新豫，关玲霞，张国坡

恢复冠状动脉血流是临床治疗缺血性心脏病的常用手段，但血流灌注后易诱发新的心脏损伤，这一现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。MIRI中最先受累部位是心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)，内皮细胞损伤被认为是触发MIRI的重要因素[2-3]。因此，寻找有效减轻和改善CMECs损伤的措施对治疗MIRI具有重要意义。延胡索乙素是中草药延胡索的有效成分之一，多用于临床镇痛和镇静[4]。有研究指出，延胡索乙素可通过抑制氧化应激和钙敏感受体/磷脂酶C-γ1途径减轻大鼠肺血管内皮细胞凋亡，实现对内皮细胞损伤的保护[5]，但其对CMECs损伤的作用报道鲜见。既往研究显示，激活蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路是延胡索乙素发挥保护MIRI的重要机制[6]；而Akt/eNOS通路活化异常与CMECs损伤密切相关[7]。本研究旨在探讨胡索乙素对缺氧(hypoxia，H)/复氧(reoxygenation，R)所致CMECs损伤的影响，为延胡索乙素保护MIRI提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 细胞：大鼠CMECs，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CP-R135，使用专用培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

试剂：CMECs专用培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CM-R135)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量检测试剂盒和大鼠白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，货号：BC0685，BC0170，BC0025，SEKR-0005，SEKR-0002，SEKR-0009)；Akt抑制剂LY294002(北京普洛麦格生物技术有限公司，货号：V1201)，Akt、磷酸化(phosphorylated，p)-Akt、eNOS、p-eNOS、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、活化的Caspase-3(cleaved-Caspase 3，C-Caspase-3)抗体(中国Abcam，货号：ab38449，ab8933，ab76198，ab76199，ab32124，ab32503，ab184787，ab214430)。

仪器：细胞缺氧实验系统(北京世联博研科技有限公司，型号：MIC-101)，酶标仪(山东竞道光电科技有限公司，型号：JD-SY96A)，流式细胞仪(北京众力挽生物科技有限公司，型号：FACSCanto Ⅱ)。

1.2 细胞培养及H/R模型构建 参照文献[8]构建H/R模型：以5% CO2和95% N2预处理无血清培养基替换原培养基，放入缺氧箱内缺氧处理3 h后，再常规复氧处理2 h。

1.3 细胞计数Kit-8(CCK-8)法检测大鼠CMECs活力[9]将对数生长期的大鼠CMECs以每孔2×104个细胞密度接种至96孔细胞板上，加入100 μL终浓度为0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL和320 μg/mL的延胡索乙素；孵育48 h后，加入10 μL CCK-8试剂孵育2 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测细胞吸光度(A)值，细胞存活率=(实验组A-调零组A)/(对照组A-调零组A)×100%。

1.4 实验分组及处理 实验分为7组。正常对照组：正常培养不做处理；模型组：构建H/R模型；溶媒对照组：以溶媒二甲基亚砜(DMSO)预处理2 h后行H/R处理；延胡索乙素低剂量组：以20 μg/mL延胡索乙素预处理2 h后行H/R处理；延胡索乙素中剂量组：以40 μg/mL延胡索乙素预处理2 h后行H/R处理；延胡索乙素高剂量组：以80 μg/mL延胡索乙素预处理2 h后行H/R处理；延胡索乙素高剂量+Akt抑制剂组：以80 μg/mL延胡索乙素和20 μmol/L LY294002预处理2 h后行H/R处理。

1.5 检测大鼠CMECs LDH、SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及Caspase-3活性 收集1.4处理结束后的各组大鼠CMECs及其上清液，分别参照各试剂盒说明书检测各组大鼠CMECs LDH、SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及Caspase-3活性。

1.6 流式细胞术检测大鼠CMECs凋亡率 收集1.4处理结束后的各组大鼠CMECs，调整细胞密度为5×105个/mL。取细胞悬液200 μL于EP管中，避光条件下加入5 μL异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ-FITC)、5 μL碘化丙啶(PI)溶液室温孵育15 min；补加200 μL上样缓冲液后，上流式细胞仪检测各组大鼠CMECs凋亡率[10]。

1.7 蛋白质印迹法(Western Blotting)检测大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表达 收集1.4中处理结束后的各组大鼠CMECs，加入裂解液提取总蛋白后，参照二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒说明书检测蛋白浓度。将变性蛋白样品按照每孔60 μg行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；待电泳分离结束后，湿转法将蛋白样品转至聚偏氟乙烯膜上；采用5%脱脂奶粉封闭1 h后，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3特异性一抗在4 ℃下孵育过夜；次日，以二抗孵育2 h后，化学发光法暗室内显影曝光；运用Quantity One软件分析各组大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表达水平，其中GAPDH为内参照。

2 结 果

2.1 不同浓度延胡索乙素对大鼠CMECs存活率的影响 CCK-8检测结果显示：经5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL延胡索乙素作用后CMECs存活率同对照0 μg/mL比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；经160 μg/mL、320 μg/mL延胡索乙素作用后CMECs存活率较对照0 μg/mL明显降低(P<0.05)。详见图1。与正常对照组比较，模型组CMECs存活率明显降低(P<0.05)，而溶媒对照组和模型组CMECs存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与溶媒对照组比较，延胡索乙素作用后CMECs存活率差异均有统计学意义(P<0.05)，且呈先升高后降低的趋势；其中，当延胡索乙素浓度在80 μg/mL时，CMECs存活率最高，40 μg/mL和20 μg/mL次之。详见图2。因此，选取20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作为低剂量、中剂量、高剂量进行后续实验。详见图2。

与0 μg/mL比较，＊ P<0.05。

模型组与正常对照组比较，＊P<0.05；延胡索乙素各剂量组与溶媒对照组比较，#P<0.05。

2.2 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs LDH、SOD和MDA水平的影响 与正常对照组比较，模型组CMECs LDH和MDA水平明显升高(P<0.05)，且SOD水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，溶媒对照组CMECs LDH、SOD和MDA水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与溶媒对照组比较，延胡索乙素作用后CMECs LDH和MDA水平明显降低(P<0.05)，SOD水平明显升高(P<0.05)，且呈延胡索乙素剂量依赖性；给予LY294002作用后，高剂量延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs LDH、MDA和SOD水平的影响明显受到抑制(P<0.05)。详见表1。

表1 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs LDH、SOD和MDA水平的影响(±s，n=9)

2.3 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，溶媒对照组大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与溶媒对照组比较，给予低剂量、中剂量和高剂量延胡索乙素作用后大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈剂量依赖性降低(P<0.05)；而给予LY294002作用后，高剂量延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的抑制作用明显削弱(P<0.05)。详见表2。

表2 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响(±s，n=9) 单位：pg/mL

2.4 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs凋亡的影响 模型组CMECs凋亡率和Caspase-3活性较正常对照组明显升高(P<0.05)；溶媒对照组和模型组CMECs凋亡率和Caspase-3活性比较差异均无统计学意义(P>0.05)；给予低剂量、中剂量、高剂量延胡索乙素作用后，CMECs凋亡率和Caspase-3活性呈剂量依赖性降低；而给予LY294002作用后，高剂量延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs凋亡率和Caspase-3活性的抑制作用明显减弱(P<0.05)。详见图3、表3。

图3 流式细胞仪检测各组大鼠CMECs凋亡情况

表3 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs凋亡率及Caspase-3活性的影响(±s，n=9)

2.5 延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表达水平明显降低，且Bax、C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；而溶媒对照组和模型组之间上述指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与溶媒对照组比较，低剂量、中剂量、高剂量延胡索乙素作用后大鼠CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性；中剂量、高剂量延胡索乙素作用后C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；给予LY294002作用后，高剂量延胡索乙素对H/R诱导的大鼠CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表达水平和Bax、C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表达水平的影响得到明显逆转(P<0.05)。详见图4。

模型组与正常对照组比较，＊ P<0.05；延胡索乙素各剂量组与溶媒对照组比较，#P<0.05；延胡索乙素高剂量+Akt抑制剂组与延胡索乙素高剂量组比较，△ P<0.05。

3 讨 论

微血管内皮细胞在维持微血管通透性和内外物质能量交换等过程中发挥着重要作用[11]；CMECs受损所致的功能异常与MIRI发生密切相关[3]。研究显示，MIRI发生与炎症反应、氧化应激和心肌细胞凋亡等密切相关[12]；在炎症和氧化应激等刺激下，内皮细胞可释放黏附分子、趋化因子和细胞因子等，引起血管收缩、白细胞聚集、血栓形成阻碍复流，进而加重MIRI[2，13]；另外，MIRI可产生大量的氧自由基，而氧自由基的过度积累可增加线粒体膜的通透性，促进凋亡诱导因子的释放，引起细胞凋亡[3]。本研究中，H/R诱导下，大鼠CMECs氧化应激指标LDH、MDA水平和促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞凋亡率、促凋亡因子Caspase-3活性、Bax蛋白表达水平均明显升高，而抗氧化应激指标SOD、抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达水平均明显降低。该结果与Chen等[14]和Zhang等[15]研究中H/R刺激可引起CMECs炎症反应、氧化应激和凋亡的结果相一致。结果表明，H/R可诱导CMECs损伤。

延胡索乙素因对心脑缺血再灌注损伤有较大的改善作用而备受关注[16]。近年来，有研究报道，延胡索乙素可能通过抗氧化、抗炎和抗凋亡机制来保护氯胺酮诱导的小鼠学习记忆障碍[17]；延胡索乙素对大鼠主动脉内皮细胞有依赖性和非依赖性血管舒张作用，可通过Akt/eNOS信号通路等途径改善血管功能障碍[18]。本研究以20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作用后发现，H/R诱导的CMECs LDH、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞凋亡率、Caspase-3活性和C-Caspase-3/Caspase-3蛋白水平、Bax蛋白表达水平均明显降低，而SOD水平和Bcl-2蛋白表达水平均明显升高。提示延胡索乙素可抑制H/R诱导的CMECs氧化应激、炎症反应和凋亡保护CMECs损伤。

Akt是参与该通路的关键因子，激活后可促进包括eNOS在内的多种靶蛋白的表达，在细胞生长、代谢和凋亡等过程中发挥重要作用[19]。Akt/eNOS信号通路活化异常与MIRI发生密切相关，一直是MIRI研究的热点[20]。Akt/eNOS信号通路还可调控细胞氧化应激、炎症反应和凋亡参与H/R诱导的CMECs损伤。本研究发现，H/R诱导下，CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平降低，而给予20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作用后，CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平明显升高；另外，给予Akt通路抑制剂LY294002作用后，80 μg/mL延胡索乙素对CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平以及对CMECs氧化应激、炎症和凋亡的影响明显逆转。提示延胡索乙素可通过激活Akt/eNOS信号通路抑制H/R诱导的CMECs氧化应激、炎症反应和凋亡。

综上所述，延胡索乙素可通过抑制炎症、氧化应激反应和减轻细胞凋亡保护H/R诱导的大鼠CMECs损伤，其作用机制可能与激活Akt/eNOS通路有关；然而，延胡索乙素保护CMECs损伤的作用机制是否还与其他通路或基因的调控有关，有待后续进一步探讨。