姜黄素类成分富集部位对高脂血症小鼠血清多不饱和鞘磷脂的改善作用*

苏超，金姝娜，张丽君，黄荣增，宋成武，尹久

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.湖北中医药大学基础医学院，武汉 430065；3.宜昌市东阳光实业发展有限公司，宜昌 443300)

姜黄为姜科姜黄属植物姜黄(CurcumalongaL.)的干燥根茎，是一种药食同源的常用中药。姜黄的主要活性成分为二苯基庚烷类，即姜黄素类化合物，其含量占原植物2%～8%[1-2]。姜黄素类成分具有众多的药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖等[3-4]。姜黄素类成分预防性药理作用一直是众多学者研究的热点，尤其在针对糖脂代谢紊乱相关疾病具有极大的应用价值[5]。课题组前期建立姜黄素类成分的分离、提取、富集、纯化工艺[6]，已使用高分辨飞行时间超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)技术对姜黄素部位的成分进行表征，并且已对不同产地的姜黄进行姜黄素类成分的含量测定[7]。

鞘磷脂(sphingomyelins，SM)是一类由神经酰胺的C-1羟基上连接磷酸胆碱(或磷酸乙醇胺)构成的鞘脂。以软脂酸及丝氨酸为原料先合成鞘氨醇后，再与脂酰CoA和磷酸胆碱合成的磷脂类成分。鞘磷脂是细胞膜及血浆脂蛋白中的重要脂质之一，具有广泛而重要的生物学功能[8]。近年来，已有研究表明鞘磷脂与糖脂代谢紊乱相关疾病有着密切的联系[9-11]。由于多不饱和脂肪酸在脂代谢异常过程中具有积极的预防保护作用[12-13]，因此研究药物对于血清多不饱和鞘磷脂含量的影响非常必要。本实验首先整合应用高分辨飞行时间液质联用仪(LC-QTOF-MS/MS)和三重四级杆线性离子阱液质联用仪(LC-QTRAP-MS/MS)建立小鼠血清多不饱和鞘磷脂的专属性定性和定量分析方法；同时利用高脂饲料诱发高脂血症动物模型，研究姜黄素类成分对高脂血症小鼠血清多不饱和鞘磷脂的调节改善作用，为姜黄调节脂代谢紊乱的药效作用机制研究提供一个新的方向。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF级)雄性昆明小鼠，体质量18～25 g，购于湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。所有小鼠在温度(24±2)℃、相对湿度45%～65%、12 h光照循环的环境下适应性喂养。

1.2试药 姜黄药材购自广东省高要市，并经湖北中医药大学生药教研室鉴定为姜黄(CurcumalongaL.)；内标化合物丹参酮IIA(纯度>98%)购自中国食品药品检定研究院；色谱纯甲醇、乙腈购自Fisher公司；分析纯甲酸、甲酸铵购自国药集团；超纯水由Milli-Q 纯水机制备；XDA-7大孔吸附树脂购西安蓝晓科技新材料股份有限公司(批号：20170710)。

1.3仪器 Triple TOFTM5600液质联用仪(AB SCIEX 公司)；QTRAP 4000液质联用仪为(AB SCIEX 公司)；HC-3618R离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；RT-9600 半自动生化分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)生化试剂盒购自南京建成生物科技有限公司(批号：20190727)。

1.4姜黄素类成分的提取、制备 参照前期实验方法[6]，取姜黄药材适量，粉碎，10倍量75%乙醇浸泡提取，滤过，旋转蒸发仪减压浓缩至适当体积，30%乙醇溶解并上样于XDA-7大孔吸附树脂，继续用30%乙醇洗脱至颜色淡黄，然后用75%乙醇洗脱，此部位即为姜黄素类成分富集部位，收集该部位洗脱液，旋转蒸发仪减压浓缩，冷冻干燥，-20 ℃冰箱保存备用。

1.5动物分组及造模给药 以随机数字表法将小鼠分为正常对照组、模型对照组、辛伐他汀组，姜黄素类成分大、小剂量组，每组6只。所有小鼠适应性喂养3 d后，除正常对照组外，模型对照组，辛伐他汀组，姜黄素类成分大、小剂量组均给予高脂饲料(蛋黄10%，猪油10%，胆固醇1%，胆盐0.2%，基础饲料78.8%)，喂养30 d后，开始灌胃给药；姜黄素类成分大、小剂量组给予姜黄素类成分富集部位，相当于生药材20，10 g·kg-1·d-1(灌胃容积0.4 mL)，正常对照组和模型对照组给予等量纯化水，辛伐他汀组给予辛伐他汀50 mg·kg-1·d-1；实验周期4周，期间记录各组小鼠体质量、进食量；实验结束后，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠1 mL·(100 g)-1麻醉小鼠，摘眼球取血，静置，4000 r·min-1离心15 min，分离血清，按照生化试剂盒方法，采用半自动生化仪检测血清TC和LDL-C水平。

1.6LC-MS/MS分析样品制备 取离心分离的血清50 μL，加入已经配好的丹参酮ⅡA(500 ng·mL-1)溶液50 μL，加入乙腈200 μL，涡旋10 min，冰浴超声15 min，12000 r·min-1离心15 min，分离上清液。沉淀用90%含水乙腈200 μL提取1次，12000 r·min-1离心15 min，分离上清液，合并2次上清液，真空离心浓缩，冷冻干燥，用甲醇250 μL复溶，备用。

1.7小鼠血清鞘磷脂定性分析 LC-QTOF-MS/MS主要用于检测多不饱和鞘磷脂的一级和二级精确分子量，对目标化合物进行定性分析。色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH Shield RP-C18(50 mm× 2.1 mm，1.7 μm)；柱温40 ℃；流速0.4 mL·min-1；进样体积10 μL；流动相A为含0.1%甲酸、10 mol·L-1甲酸胺的水相，流动相B为乙腈有机相，梯度条件为：0～0.1 min，82%B；>0.1～15 min，82%→85%B；>15～20 min，85%→90%B；>20～24 min，90%→ 98%B；>24～27 min，98%B；27.1 min，82%B；>27.1～30 min，82%B；正离子模式检测记录数据；质谱参数：毛细管电压：5500 V；离子源温度：550 ℃；雾化气：50 psi；加热气：50 psi；去势电压：140 V ；碰撞能量：40 eV；一级分子量扫描范围为100～1250；二级分子量扫描范围为50～250。

1.8小鼠血清鞘磷脂相对定量分析 对于鞘磷脂类成分分析方法的建立，是基于课题组前期工作完成[14]。LC-QTRAP-MS/MS主要用于检测上述已定性分析后确定的多不饱和鞘磷脂目标化合物的相对定量。色谱条件同“1.7”项；各项质谱参数如下：毛细管电压：5500 V；离子源温度：500 ℃；雾化气：50 psi；加热气：50 psi；去势电压：140 V ；碰撞能量：40 eV；采用正离子模式下LC-QTRAP-MRM(多反应监测模式)，即离子对检测方式进行相对定量分析。

1.9方法学验证

1.9.1日内精密度考察 取小鼠血清提取物，按“1.8”项下方法，1 d内平行进样6次，计算各鞘磷脂类成分相对峰面积的RSD。

1.9.2日间精密度考察 取小鼠血清提取物，按“1.8”项下方法，连续3 d平行进样6次，计算各鞘磷脂类成分相对峰面积的RSD。

1.9.3基质效应考察 取小鼠血清提取物，按“1.8”项下方法，以不同进样量(2，5，10 μL)进样，根据各鞘磷脂类成分MS信号考察基质效应。

2 结果

2.1姜黄素类成分对高脂血症小鼠体质量、血清TC和LDL-C的作用 实验期间，所有小鼠均无异常死亡；各组小鼠的日均进食量比较差异无统计学意义。实验结果见表1，与模型对照组比较，经过4周灌胃给药治疗，姜黄素类成分可以显著降低高脂血症小鼠体质量、血清TC和LDL-C水平，在下调血清TC和LDL-C方面，姜黄素类成分大剂量组效果优于小剂量组。

2.2小鼠血清中多不饱和鞘磷脂的定性分析 鞘磷脂在正离子质谱模式中可以裂解出184.073 3典型的碎片(图1)，分子结构中含有2个N原子，因此鞘磷脂的分子量均为偶数，可以很好将其与磷脂酰胆碱区分开(结构中只有1N原子，分子量为奇数)。

采用PeakView SoftwareTM软件中前体离子过滤(Precursor ion filter)功能，可以确定血清中鞘磷脂类成分。同时，结合目标化合物的高分辨质谱一级精确分子量，可以得到各化合物的分子式，进而计算出不饱和度；最后，经过对数据系统分析，共鉴定出小鼠血清中16个多不饱和鞘磷脂类成分(多不饱和脂肪酸是指脂肪酸链上具有两个或两个以上的双键)，结果见图2、表2。

2.3方法学验证 于1日内平行进样6次测定小鼠血清提取物，16个多不饱和鞘磷脂类化合物相对峰面积RSD为3%～12%，表明日内精密度良好；连续3 d平行进样小鼠血清提取物6次，各化合物相对峰面积RSD为3%～16%，表明日间精密度良好；以不同进样量(2，5，10 μL)考察基质效应，根据各化合物的MS响应值计算RSD，结果为8%～14%，因此可以认为本研究基质效应干扰较小。

表1 5组小鼠体质量、血清TC和LDL-C的检测值

图1 鞘磷脂SM(d18：1/16：0)的结构特征及其在正离子模式中典型碎片离子

2.4小鼠血清中多不饱和鞘磷脂的相对定量分析 采用MRM模式，利用已知的离子对(分子离子峰作为母离子；184.0733碎片离子作为子离子)和保留时间，对所有检测到的多不饱和鞘磷脂进行相对定量分析。图3中所有点的含义为目标成分峰面积(与内标相比后)与模型对照组小鼠血清中该成分的峰面积(与内标相比后)的比值，即变化倍数关系。经过数据分析，与正常对照组比较，高脂血症模型小鼠血清中多不饱和鞘磷脂呈现显著的下降趋势(黑色点均在红色点右边)，而姜黄素类成分具有显著的回调改善作用，且偏离红色中心越远，则效果越明显。

图2 基于LC-QTOF-MS/MS的血清多不饱和鞘磷脂提取离子流质谱图

表2 LC-QTOF-MS/MS定性分析高脂血症小鼠血清中多不饱和鞘磷脂类化合物

3 讨论

姜黄对于高脂血症的调节作用已被众多文献报道，有关其降血脂的作用机制大多集中在分子生物学方面，利用靶标性代谢组学方法探讨其降血脂药效作用机制不多。笔者在本研究整合利用2种功能互补的LC-MS/MS，基于靶标性代谢组学的方法[15]，对小鼠血清中多不饱和鞘磷脂类成分进行相对定量分析，并应用于姜黄素类成分调节脂代谢紊乱的药效学研究，实验结果表明高脂血症小鼠血清中多不饱和鞘磷脂类化合物的相对含量较正常小鼠显著降低，而姜黄素类成分具有显著的改善作用，并趋向于正常小鼠回调该类脂质分子。已有文献报道高脂血症与血清中的多不饱和脂肪酸含量密切相关[16- 17]。由于血清中大部分脂肪酸来源于三酰甘油或磷脂类成分，而鞘磷脂属于磷脂的一种，随着鞘磷脂的水解，会伴随有鞘氨醇和游离脂肪酸生成[18]。因此，同时监测血清中多不饱和鞘磷脂的相对含量，筛选具有生物学意义的鞘磷脂生物标志物，对于研究高脂血症的发生、发展及预后具有重要意义。

图3 小鼠血清中多不饱和鞘磷脂的相对含量变化

综上所述，姜黄素类成分对高脂血症小鼠血清中多不饱和鞘磷脂的回调作用可能涉及姜黄调节脂代谢紊乱的药效作用机制，值得深入研究。项目后期将针对血清多不饱和鞘磷脂类成分的提取方法进行优化，并进一步优化质谱检测方法，以期检测到更多的该类成分并进行相应的定量分析，同时更深入地研究姜黄素类成分对多不饱和鞘磷脂类化合物相关代谢通路的影响。