罗哌卡因对骨关节炎疼痛大鼠炎症反应及PKA/CREB通路的影响

林玉美， 符明君， 陈基胜

(海南省海口市第三人民医院麻醉科， 海南 海口 571100)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性骨代谢疾病，以关节软骨退行性变及继发性骨质增生为特征，常引起关节疼痛、僵硬等行为功能障碍，严重可造成残疾，影响患者身心健康。炎症反应是OA发病过程中的主要病理反应，可引起软骨细胞凋亡、细胞外基质降解及骨质增生，损伤软骨组织，在OA进展中扮演重要角色[1]。目前尚无有效能根治OA的措施，临床治疗OA主要是缓解关节疼痛并改善关节功能，以延缓OA进展，但也存在疗效差、副作用大等问题。罗哌卡因是临床常用的长效酰胺类局部麻醉药物，常用于膝关节镜检查中，发挥镇痛效果[2]。有研究发现，罗哌卡因用于锁骨下阻滞患者进行动静脉瘘手术镇痛时可发挥抗炎作用[3]。关节腔内注射复方倍他米松注射液、玻璃酸钠及罗哌卡因混合液能抑制OA患者炎症反应，缓解疼痛并促进关节功能恢复，但罗哌卡因单独对OA炎症反应的影响尚不明确[4]。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是G蛋白偶联受体家族成员，其激活后可调控下游因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)，参与疼痛的传递与调节[5]。有研究发现，PKA/CREB通路在神经病理性痛大鼠疼痛及炎症反应调控中发挥重要作用[6]。本研究将探讨罗哌卡因对OA疼痛大鼠炎症反应及PKA/CREB通路的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1实验动物：SPF级SD健康雄性大鼠，体质量230-260g，周龄6-8周，购自珠海百试通生物科技有限公司，许可证号：SCXK(粤)2020-0051。饲养于18-23℃的动物房中，调节昼夜12h/12h，湿度40%-60%。大鼠可自由饮水及摄取饲料。

1.1.2主要试剂与仪器：罗哌卡因(国药准字H20203032)购自山东方明药业集团股份有限公司；大鼠IL-1β(货号：SEKR-0002)、IL-6(货号：SEKR-0005)、TNF-α(货号：SEKR-0009)酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒及苏木精-伊红染色试剂盒(货号：G1120)购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗p-PKA(货号：ab5815)、兔抗PKA(货号：ab216572)、兔抗p-CREB(货号：ab32096)、兔抗CREB(货号：ab32515)、兔抗GAPDH(货号：ab9485)、羊抗兔IgG(货号：ab6721)购自英国Abcam；电子压痛仪(型号：YLS-3E)购于天津诺雷信达科技有限公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)购于Applied Biosystems公司；凝胶成像仪(型号：GelDocEZ)购于美国Bio-Rad公司。

1.2方 法

1.2.1实验分组、OA大鼠模型制备及给药：大鼠随机分为假手术组、OA组及罗哌卡因低、中、高剂量组，每组16只。OA组及罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠复制OA模型[7]：大鼠麻醉、双侧下肢膝关节备皮，从髌旁内侧切口，髌骨向外侧脱位，显露前交叉韧带并切断，髌骨复位，缝合关节腔及切口，连续肌注青霉素3d预防感染。假手术组仅显露前交叉韧带而不切断，其他处理同上。术后大鼠双下肢固定，分笼饲养。模型复制后第3周开始给药，罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠分别腹腔注射0.5、1、2mg/kg罗哌卡因[8]，其余组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每日1次，给药2周结束。

1.2.2压痛阈值测定：于模型复制前、模型复制2周、给药2周，将大鼠以舒适又固定的姿势装进固定桶中，用YLS-3E电子压痛仪的扁型头在大鼠双侧后足背施压，以大鼠因疼痛而鸣叫、挣扎时读取的压力值为大鼠的压痛阈值，每只每侧重复测量3次，间隔时间为15min，取每只6次的平均值。

1.2.3血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α检测：给药结束后，大鼠腹主动脉抽取血样2mL，12000r/min离心15min，留取血清，使用ELISA试剂盒检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，检测步骤按试剂盒说明书执行。

1.2.4软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α、PKA、CREB mRNA表达水平测定：各组取8只大鼠断颈处死，取双下肢软骨组织研碎，使用TRIzol试剂分离总RNA，反转录获得cDNA，使用荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR反应。反应条件：94℃ 10min；94℃10s，56℃ 10s，72℃ 10s，循环40次。引物序列如下，IL-1β上游：5'-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3'，下游：5'-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3'；IL-6上游：5'-ATTGTATGAACAGCGATGATGCAC-3'，下游：5'-CCAGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3'；TNF-α上游：5'-GCCGTCTACTCCT CCCCGTGT-3'，下游：5'-GTCTCTCTCCTACCCTCTGG-3'；PKA上游：5'-TCGAAGGCGACCTCAAGTG-3'，下游：5'-TTCGGTGTAGCTTTGGATCCA-3'；CREB上游：5'-ACCGTCGCCCATCATCAA-3'，下游：5'-TTGCACTGCCAACTCTTTGTCT-3'；GAPDH上游：5'-ATGACTCTACCCACGGCAAG-3'，下游：5'-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3'。以GAPDH为内参基因，使用2-ΔΔCt法表示IL-1β、IL-6、TNF-α、PKA、CREB mRNA表达结果。

1.2.5软骨组织病理形态变化观察:各组剩余8只大鼠断颈处死，取右下肢膝关节软骨组织，生理盐水冲洗，用4%多聚甲醛固定48h，放入EDTA中脱钙4周，酒精脱水，石蜡包埋、切片(厚度5μm)，切片进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察软骨组织病理形态变化。

1.2.6软骨组织PKA/CREB通路相关蛋白检测:各组剩余8只大鼠取左下肢软骨组织，加裂解液研磨匀浆裂解30min，12000r/min离心15min收集蛋白上清，定量后取40μg进行10%凝胶电泳分离，将目的条带转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h，加一抗(兔抗PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、GAPDH，1∶1000)4℃孵育过夜，加二抗(辣根过氧化物酶标记，羊抗兔IgG)室温孵育1h，滴加发光液，凝胶成像仪拍照，统计灰度值，以GAPDH为内参蛋白，计算目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠压痛阈值:模型复制前，各组大鼠压痛阈值差异无统计学意义(P>0.05)。模型复制2周，OA组及罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠压痛阈值均显著降低(P<0.05)。给药2周，与假手术组相比，OA组大鼠压痛阈值显著降低(P<0.05)；与OA组相比，罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠压痛阈值均显著升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表1。

表1 各组大鼠压痛阈值比较

2.2各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平:与假手术组相比，OA组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与OA组相比，罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表2。

表2 各组大鼠血清IL-1β IL-6 TNF-α水平比较

2.3各组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、PKA、CREB mRNA表达水平:与假手术组相比，OA组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、PKA、CREB mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与OA组相比，罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、PKA、CREB mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表3。

表3 各组大鼠软骨组织中IL-1β IL-6 TNF-α PKA CREB mRNA表达水平比较

2.4各组大鼠软骨组织病理形态:假手术组软骨组织表面平整，软骨细胞排列整齐、分布均匀。OA组软骨组织表面有缺损或严重增生，细胞形态畸变、排列紊乱，有组织充血、肿胀、炎性细胞浸润等病变现象。罗哌卡因低、中、高剂量组软骨组织中细胞畸变、组织充血、炎性细胞浸润等病变现象有不同程度地减轻，见图1。

图1 各组大鼠软骨组织病理形态(×200)

2.5各组大鼠软骨组织PKA/CREB通路相关蛋白表达水平:与假手术组相比，OA组大鼠软骨组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与OA组相比，罗哌卡因低、中、高剂量组大鼠软骨组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图2、表4。

图2 各组大鼠软骨组织p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表达情况

表4 各组大鼠软骨组织p-PKA/PKA p-CREB/CREB蛋白表达水平比较

3 讨 论

OA作为累及膝关节软骨的关节退变性疾病，常导致患者关节疼痛、肿胀，随着疾病的进展，可最终导致关节畸形，严重影响患者生活质量。OA好发于中老年群体，据研究报道，45岁以上群体中OA患病率达8.1%，而随着人口老龄化的加剧，OA患病率会进一步增加[9]。目前OA尚无有效的根治方式，只能采取措施延缓病情，不仅危害患者的身心健康，还会给其家庭及社会造成严重负担。目前，OA药物疗法中的常用药物有非甾体类抗炎药、对乙酰氨基酚、阿片类药物和麻醉剂等，但均存在不同程度的副作用，寻找新的药物改善患者病情仍迫在眉睫。

本研究采用切断前交叉韧带的方式复制OA模型，2周后可见大鼠压痛阈值降低，血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平及其在软骨组织中的mRNA水平升高，且软骨组织产生明显病变，表明大鼠膝关节软骨炎症反应严重，已出现关节软骨退行性变，即成功建立OA疼痛大鼠模型。罗哌卡因是常用于手术中或手术后的麻醉药，主要发挥镇痛作用，可改善乳房切除术后急性疼痛程度[10]，可用于髌骨骨折固定术后镇痛并降低其局部炎症反应[11]，还可减轻膝骨关节炎患者经关节镜下清理术后的疼痛，帮助恢复膝关节功能[12]。本研究亦显示，不同剂量罗哌卡因可提高OA大鼠压痛阈值，即罗哌卡因能减轻OA大鼠的疼痛程度，且具有剂量依赖性；同时降低血清及软骨组织中炎症因子水平，改善软骨组织细胞畸变、炎性细胞浸润等病理现象，即能降低OA大鼠炎症反应，缓解膝关节软骨退行性变病情。

PKA/CREB通路是与痛记忆发生相关的信号通路，可激活巩固痛记忆，其中通路下游的核转录因子是存储疼痛记忆的核心蛋白[13]。研究发现，激活PKA/CREB通路可通过介导突触体相关蛋白25上调，进而在神经性疼痛中起重要作用[14]；而抑制该通路激活可抑制炎症因子表达，对神经病理性痛大鼠发挥镇痛效果[6]。本研究结果显示，PKA/CREB通路相关基因PKA、CREB的转录及蛋白磷酸化水平升高在OA大鼠软骨组织中显著升高，表明PKA/CREB激活可能与OA发生及疼痛、炎症反应等症状产生有关。罗哌卡因治疗可降低OA大鼠软骨组织中PKA、CREB的转录及蛋白磷酸化水平，表明罗哌卡因减轻膝关节疼痛感及体内炎症反应，可能与抑制软骨组织中PKA/CREB通路的激活有关。

综上所述，罗哌卡因可抑制PKA/CREB通路激活，减轻OA大鼠的膝关节疼痛程度，降低体内炎症反应，延缓病情，对OA治疗具有一定参考价值。