右美托咪定调控miR-132-3p对缺氧复氧诱导的脑微血管细胞损伤的影响

王少微， 邢 珍， 张立立， 贾 彤， 姚 杰， 李福龙， 王 丽

(1.河北北方学院附属第一医院麻醉科， 河北 张家口 075000 2.河北省眼科医院麻醉科， 河北 邢 台 054001)

人脑微血管内皮细胞(HBMEC)是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑，其损伤与脑缺血、脑梗死、脑水肿等脑血管疾病的病理过程有着密切的关系[1,2]，抑制HBMEC损伤对脑血管疾病的治疗尤为重要。右美托咪定(Dex)是一种相对选择性α2-肾上腺素受体激动剂，具有镇静作用。研究显示，Dex可通过抑制JNK通路激活减轻缺氧/复氧(H/R)诱导的肺泡上皮细胞损伤[3]，还可通过抑制内质网应激减少H/R)诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激，发挥心肌保护作用[4]。但Dex对脑微血管内皮细胞损伤影响和机制还未知。miRNA也在脑血管细胞中有表达，miRNA在缺血性脑血管病发病、诊断、治疗中的临床应用中效果显著[5]。miRNAs影响急性脑血管病患者认知障碍[6]。miR-132-3p在H/R诱导的心肌细胞中表达降低，过表达miR-132-3p提高H/R诱导的心肌细胞活力，并抑制细胞凋亡，减少活性氧产生，miR-132-3p可作为治疗心肌梗死的分子靶点[7]。Dex能否调控miR-132-3p影响HBMEC损伤还未知。本实验探究了Dex对H/R诱导的HBMEC损伤的影响及其能否调控miR-132-3p发挥作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料:人HBMEC细胞系，美国ATCC公司；DEX，江苏恒瑞医药股份有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；MDA、SOD和CAT试剂盒，美国Hyclone公司；RNA-Trizol试剂购、逆转录(RT)试剂盒、聚合酶链式反应(PCR)试剂盒，日本Takara公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养与H/R损伤模型建立:HBMEC细胞用含10% FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80%以上时，胰蛋白酶消化，取传代细胞进行之后实验。建立H/R损伤模型，HBME细胞缺氧培养24h后再复氧培养24h。

1.2.2实验分组:体外培养人HBMEC细胞，作为Con组，建立H/R损伤模型，作为H/R组，用低(0.01μmoL/L)、中(0.10μmoL/L)、高(1.00μmoL/L)剂量的Dex干预后，建立H/R模型，作为H/R2+Dex-L组、H/R+Dex-M组、H/R+Dex-H组。分别转染miR-NC、miR-132-3p模拟物HBMEC后，建立H/R模型，作为H/R+miR-NC组、H/R+miR-132-3p组；分别转染anti-miR-NC、anti-miR-132-3p，用高剂量(1.00μmoL/L)Dex干预后，建立H/R模型，作为H/R+anti-miR-NC+Dex组、H/R+anti-miR-132-3p+Dex组。

1.2.3ELISA法检测细胞炎性因子水平:ELISA试剂检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按照试剂盒附带的说明书进行实验。

1.2.4试剂盒检测细胞氧化应激水平:使用试剂盒检测细胞中MDA、SOD、CAT、GSH-PX水平，实验步骤依据说明书进行实验。

1.2.5实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-132-3p表达:各组细胞培养48h，提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照试剂盒使用说明进行RT-qPCR，每个样品设3个重复，循环条件为95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s；72℃ 30s，共40个循环；60℃延长5min。用2-△△Ct法计算相对表达水平。引物由上海生工生物工程公司合成。

2 结 果

2.1Dex对H/R诱导的HBMEC细胞炎性因子的影响:与Con组比较，H/R组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与H/R组比较，H/R2+Dex-L、H/R+Dex-M、H/R+Dex-H组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，见表1。

表1 Dex对H/R诱导的HBMEC细胞炎性因子的影响

2.2Dex对H/R诱导的HBMEC细胞氧化应激的影响:与Con组比较，H/R组细胞MDA水平升高，SOD、CAT水平降低(P<0.05)；与H/R组比较，H/R2+Dex-L、H/R+Dex-M、H/R+Dex-H组细胞MDA水平降低，SOD、CAT水平升高(P<0.05)，见表2。

表2 Dex对H/R诱导的HBMEC细胞氧化应激的影响

2.3Dex对H/R诱导的HBMEC细胞miR-132-3p表达的影响:与Con组比较，H/R组细胞miR-132-3p表达降低(P<0.05)；与H/R比较，H/R2+Dex-L、H/R+Dex-M、H/R+Dex-H组细胞miR-132-3p表达升高(P<0.05)，见表3。

表3 Dex对H/R诱导的HBMEC细胞miR-132-3p表达的影响

2.4上调miR-132-3p对H/R诱导的HBMEC细胞炎性因子和氧化应激的影响:与H/R+miR-NC组比较，H/R+miR-132-3p组IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平降低，SOD、CAT水平升高(P<0.05)，见表4。

表4 上调miR-132-3p对H/R诱导的HBMEC细胞炎性因子和氧化应激的影响

2.5抑制miR-132-3p逆转Dex对H/R诱导的HBMEC细胞炎性因子和氧化应激的影响:与H/R+anti-miR-NC+Dex组比较，H/R+anti-miR-132-3p+Dex组IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平升高，SOD、CAT水平降低(P<0.05)，见表5。

表5 抑制miR-132-3p逆转Dex对H/R诱导的HBMEC细胞炎性因子和氧化应激的影响

3 讨 论

脑部疾病大多数与人脑微血管内皮细胞受到损伤有关[8]，人脑微血管内皮细胞发病机制复杂，涉及细胞凋亡、炎症反应、氧化应激等[9]，通过采取措施抑制或减轻人脑微血管内皮细胞损伤对脑血管疾病治疗十分必要。

研究显示，右美托咪定可抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β，减轻小鼠巨噬细胞炎性损伤[10]。右美托咪定可降低脓毒症相关脑病大鼠氧化应激，改善大鼠神经功能，并缓解神经细胞凋亡[11]。本实验结果显示，Dex可呈剂量依赖性抑制H/R诱导的人脑微血管内皮细胞炎性因子表达和氧化应激水平，提示其可减轻H/R诱导的人脑微血管内皮细胞损伤，具有脑保护作用。

miRNA可靶向靶基因表达参与调控细胞凋亡、炎症反应、氧化应激等生理或病理过程，可作为脑损伤在内的多种疾病的治疗靶点。作为一种miRNA，miR-132-3p的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。研究显示，miR-132-3p在β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导的神经元中表达下调，上调miR-132-3p减轻Aβ25-35诱导的神经元损伤[12]。本实验结果显示，人脑微血管内皮细胞经H/R诱导后，细胞中miR-132-3p表达下降，上调miR-132-3p抑制H/R诱导人脑微血管内皮细胞炎症因子表达和氧化应激，与报道结果一致[13]，提示miR-132-3p也可作为脑损伤治疗的分子靶点。此外，本研究结果显示，Dex促进H/R诱导人脑微血管内皮细胞中miR-132-3p表达，下调miR-132-3p逆转Dex对H/R诱导人脑微血管内皮细胞炎症因子表达和氧化应激的影响，提示Dex可能通过上调miR-132-3p发挥脑保护作用，但其作用的miR-132-3p靶基因还有待进一步探究。

综上所述，Dex上调miR-132-3p抑制H/R诱导的人脑微血管内皮细胞损伤，这为治疗脑部疾病提供了理论基础。