鼠李糖杆菌通过干预炎性反应治疗大鼠缺血性脑损伤

邵延萱 罗文哲 崔延昆 张雪松 盛延良 殷悦

(佳木斯大学 1临床医学院,黑龙江 佳木斯 154007；2基础医学院)

脑卒中是发病突然的一类因脑血液循环障碍所引起的疾病，死亡率为60.0%。其中，因缺血所引起的脑卒中约占所有脑卒中病例的87.0%。脑组织缺血性死亡可引起炎症和脑水肿，预后恶化。研究表明多种疾病，如血栓形成、心血管系统疾病、哮喘、肥胖、结肠炎、结肠癌及一些精神疾病和神经退行性疾病，均可由肠道菌群失调而引起。而脑肠轴双向作用机制的提出，为肠道微生物与脑血管病之间的研究提供了有力的科学支撑，肠道微生物菌群与脑之间可能存在多种方式进行联系及相互影响〔1〕。本研究旨在从益生菌调整肠道微生态学角度阐明缺血性脑损伤与炎症的关系及潜在的调控机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级SD雄性大鼠〔(240±20)g，9周龄〕由佳木斯大学实验动物中心机构提供。在温度23～25℃，湿度13%，氧气充足条件下饲养。所有动物研究按照佳木斯大学实验动物中心机构动物伦理关怀委员会批准的方案和指南进行。

1.1.2材料与仪器 水合氯醛、酒精、二甲苯、苏木素、伊红、磷酸盐缓冲液(PBS)等(北京化学试剂六厂)；目的蛋白及内参一抗(CST公司)；鼠李糖杆菌(山东中科嘉亿生物工程有限公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉酶免生物科技有限公司)。电泳仪、恒温水浴锅(北京六一仪器厂)；图像采集系统(莱卡显微镜)；离心机(上海知正离心机公司)；切片机、封片机(新乡市维克科教仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组 选取15只大鼠(200～250 g)，随机分为3组，每组5只，分别为：假手术组(A组，所做切口不结扎+生理盐水)；颈动脉结扎+生理盐水组(B组)；颈动脉结扎+鼠李糖杆菌组(C组)。建模后饲养14 d，给予足够饮食与水，每天监测体重。

1.2.2缺血脑损伤动物模型 麻醉大鼠(10%水合氯醛，3 ml/kg)，平卧，固定，颈部行纵向切口。分离胸锁乳突肌，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，分别隔离。用6-0丝线在两侧颈总动脉进行结扎，为了保证效果，在动脉的远端和近端进行双重处理；A组仅做切口与分离处理，但并不进行结扎，伤口用碘消毒并缝合。脑缺血模型建立后，大鼠出现双目失明和绕圈行走，不能直线行走。根据Longa评分法〔2〕评价测试结果为3分，表明成功建立脑缺血模型，能够模拟缺血性脑卒中的疾病状态。动物模型构建成功后采外周血，离心并进行低温保存。取小肠，肠标本的采集于各组规定时间进行解剖开腹取小肠，采用0.9%氯化钠进行冲洗，再进行固定。取脑组织，一部分在甲醛溶液内固定，用于组织形态学检测；一部分-80℃冻存，用于后期检测分析。

1.2.3ELISA 取2 ml外周血离心，离心时间20 min，离心速度3 500 r/min，将每支试管中上清液取出，-20℃保存。根据ELISA试剂盒说明书，检测脑及肠中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及外周血中血栓素(TX)B2水平。

1.2.4石蜡切片的制作 取大鼠大脑及小肠部，用FAA液进行固定，流水冲洗。乙醇低到高浓度梯度脱水，二甲苯+无水酒精混合液透明1 h。将材料放入溶解的纯蜡中，时间为30 min，该过程再重复2次。包埋机器包埋组织块，实验前切片。

1.2.5免疫组化检测 石蜡切片脱蜡。3%过氧化氢(H2O2)室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。5%～10%正常山羊血清(PBS 稀释)封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h或4℃过夜。PBS冲洗，滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30 min。PBS冲洗，滴加适量的辣根过氧化物酶，37℃孵育10～30 min。PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色3～15 min，自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。脑组织样本进行免疫组化检测Toll样受体(TLR)4、髓样分化因子(MyD)88、核因子(NF)-κB、内皮细胞闭合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白(Clandin)-1、闭锁小带蛋白(ZO)-1。肠组织样本进行免疫组化检测Occludin、Clandin-1、ZO-1。

1.2.6Western印迹 将组织与裂解液按照100 mg∶1 ml的比例进行处理，保持低温，快速匀浆，4℃ 12 000 r/min离心5 min，取部分上清液进行定量，加结合缓冲液95～100℃处理5 min，冷冻保存或上样。电泳-转膜-封闭-一抗过夜-TBST清洗-二抗室温1 h-TBST清洗-化学发光成像。

1.3统计学分析 采用Graphpad Prism9.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1各组炎性因子水平比较 A组外周血TXB2及脑和肠中TNF-α、IL-1β水平均显著低于B组，B组外周血TXB2及脑和肠中TNF-α、IL-1β水平均显著高于C组(P<0.05)。见表1。

表1 各组炎性因子水平比较

2.2各组TLR4-NF-κB信号通路相关蛋白水平比较 A组TLR4、NF-κB、MyD88水平均显著低于B组，B组TLR4、NF-κB、MyD88水平均显著高于C组(P<0.05)。见表2、图1。

2.3各组脑及肠组织中紧密连接蛋白水平比较 脑及肠组织中Occludin、Clandin-1、ZO-1水平比较：A组>C组>B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、表4、图2、图3。

表2 各组TLR4-NF-κB信号通路相关蛋白 水平比较

图1 脑部TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达(免疫组化，×400)

表3 各组脑组织中紧密连接蛋白水平比较

表4 各组肠组织中紧密连接蛋白水平比较

图2 脑部ZO-1、Occludin、Clandin-1水平(免疫组化，×400)

图3 肠部ZO-1、Occludin、Clandin-1水平(免疫组化，×400)

3 讨 论

缺血性脑损伤由于供血异常而引起机体供氧量异常及新陈代谢会发生变化〔3〕，小神经胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，当被激活后，可释放大量炎症和细胞毒性介质，这些介质与神经功能障碍和脑损伤有关〔4〕。小胶质细胞表达的TLRs是模式识别受体的一个亚家族，识别入侵的病原体和内源性有害刺激，从而诱发先天性和适应性免疫反应〔5〕。其中TLR4是常见的研究对象，通过介导NF-κB信号通路，进而影响炎性因子的表达。研究证明脂多糖(LPS)等炎性因子与TLR4结合，通过MyD88途径介导炎症〔6〕。活化的TLR结构域结合MyD88形成TLR-MyD88复合体，导致下游蛋白IRAK1和TRAF6的磷酸化，激活NF-κB信号通路并进入细胞核调节相关基因表达。研究证明胡椒碱通过抑制NF-κB信号通路中 kappa 光多肽核因子增强子的表达，进而抑制促炎性细胞因子的表达〔7〕。

血脑屏障(BBB)的内皮细胞与紧密连接蛋白相互接触，包括Occludin，ZO-1和Claudins，它们与相邻的内皮细胞相互作用，形成阻止细胞旁扩散的物理屏障〔8〕。可以说BBB的功能依赖于紧密连接蛋白的完整性。本研究结果表明肠屏障(IB)和BBB的通透性变大。炎性因子表达的增强与紧密连接蛋白的表达下降综合考虑可推测炎性因子的存在，导致IB、BBB产生相应的变化。Chen等〔9〕血管周围 M1样小胶质细胞诱导的内皮细胞坏死导致发现BBB受损，需要 M1型小胶质细胞分泌TNF-α及其受体TNFR1介导。肠道细菌可影响中枢神经系统(CNS)的生理功能和炎症的发生〔10〕。

研究显示导致溃疡性结肠炎(UC) 癌变的一个可能原因是上皮细胞损伤和修复的重复周期〔11〕。在这个过程中可产生过多的促炎症细胞因子，如TNF-α和IL-6。肠道微生物群可以影响 UC的发生〔12〕，因为它诱导了持续性肠道炎症。益生菌被用作UC 患者的补充剂，对 UC的治疗效果显著〔13，14〕。可见菌群与炎性因子的产生存在相关作用的可能。

综上，缺血性脑损伤改变了肠道微生物群的组成，而益生菌可通过调节免疫反应降低缺血性脑损伤的损害。