灵芝多糖对脂多糖诱导小鼠肝损伤的保护效应

2022-05-26 09:44李向辉吴艳玲崔振宇
中国老年学杂志 2022年10期
关键词:氧化应激多糖机体

李向辉 吴艳玲 崔振宇

(1延边大学药学院 朝药研究国家民委重点实验室,吉林 延吉 133002;2中国人民武装警察部队吉林省总队医院药剂科)

近年肝损伤发病率呈上升趋势,其发病机制较为复杂,尚未阐述明晰,氧化应激和炎症刺激是肝脏损伤主要病理特征〔1〕。氧化应激是机体内氧化与抗氧化动态平衡被打破的主要状态,一旦氧化应激形成,不仅是体内氧化与抗氧化的失衡,更重要的是由于失衡所造成的诸多稳态失衡,如中性粒细胞炎性浸润,氧化中间产物增多诱发的炎症因子、细胞因子等。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌胞壁内毒素主要成分,而肝脏是肠源性LPS攻击主要靶器官。LPS通过Th1细胞因子导致肝脏损伤,其诱导小鼠模型可以较好地模拟人肝炎发病的病理过程。

灵芝为多孔菌科真菌赤芝,是一种珍贵的药食两用菌。由于灵芝的营养成分丰富且营养价值高,灵芝保健品已在我国甚至国外逐步兴起。灵芝多糖(GLP)是灵芝中最有效的成分之一,已分离出200多种,多为β-葡聚糖,多糖链呈螺旋立体状,以氢键连接,分子量由几百至数十万〔2〕。GLP在热水中的溶解性极佳,所以能发挥促进血液循环保健功能〔3〕。GLP具有广泛的药理作用,可提高机体免疫力和耐缺氧能力。此外,GLP还具有降血糖、降血脂、抗肿瘤等生理功能〔4~6〕。本研究主要探讨GLP对LPS诱导小鼠肝损伤的保护效应机制。

1 材料及方法

1.1实验动物 30只雄性C57L/6小鼠购于长春忆斯动物有限公司〔动物许可证号:SYXK(吉)2020-0010〕。小鼠分组单笼饲养,温度控制于(25±2)℃,湿度控制为(45±5)%,自由饮食饮水,饲养环境明暗12/12 h循环。动物实验相关操作均遵循延边大学实验动物伦理委员会相关规定。适应性饲养1 w,分为正常组、模型组、GLP低剂量(GLP-L)组(3.75 g/kg GLP)、GLP中剂量(GLP-M)组(7.50 g/kg GLP)、GLP高剂量(GLP-H)组(11.25 g/kgGLP),分组后每天给药1次,连续给药4 w。末次给药24 h后腹腔注射LPS(10 mg/kg)诱导小鼠急性肝损伤,12 h后麻醉采血,室温下放置2 h,血清分层后低温离心,4 000 r/min离心10 min,收集上清保存于-80℃冰箱中备用。收集肝脏组织,-80℃冰箱保存以备后续检查。

1.2药材与试剂 GLP制备:灵芝菌丝体100 g,先用乙醇预处理,去除脂类物质,并使糖苷酶失活,防止多糖降解。随后加入总重量20倍体积的95℃热水浸提60 min,连续浸提3次,合并3次浸提液,减压浓缩,加入3倍体积的95%乙醇,静置12 h,离心,加入75%乙醇反复洗涤,沉淀多糖,获得粗多糖。采用sevage法去蛋白质,再经硼酸型deae纤维素柱层析法纯化。蒽酮-硫酸法测定GLP含量为1.5 mg/g。

1.3主要仪器 电子天平(赛多利斯);离心机(Sigma);-80℃冰箱(Haier);酶标仪(Bio Tek);台式高速离心机(德国Sigma);天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),白细胞介素(IL)-1α(上海联祖生物科技有限公司)。

1.4样品收集与处理 在末次给药24 h后,对小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,颈动脉取血,收集的血液样品经静置(4℃,60 min)后离心(3 500 r/min,15 min,4℃)得到血清,置于-80℃冰箱保存,用于小鼠血清中ALT、AST、IL-1α指标测定。将肝脏组织剥离后盐水清洗,滤纸吸干即刻置于液氮中,待冷冻后转存于-80℃冰箱中,用于SOD、MDA、GSH-Px水平检测。

1.5血清生化分析 将收集的小鼠血浆,室温静置2 h,在4℃下,4 000 r/min离心10 min,收集上清。测定分析小鼠血清ALT、AST、IL-1α水平,按照试剂盒说明书进行测定。

1.6肝脏组织中SOD、GSH-Px及MDA水平检测 取20 mg肝组织,加入9倍量体积生理盐水研磨,涡旋混匀3 min,离心(12 000 r/min,15 min,4℃)两次,获得上清液,按照试剂盒说明书检测小鼠肝组织中的SOD、GSH-Px及MDA水平

1.7数据处理 采用GraphPad Prism9.0软件进行单因素方差分析、Tukey多重比较检验。

2 结 果

2.1GLP对LPS诱导的急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性的影响 与正常组比较,模型组血清中AST和ALT活性显著升高(P<0.001),说明小鼠急性肝损伤模型造模成功;与模型组比较,GLP-L、GLP-M、GLP-H组均能显著抑制LPS诱导的肝损伤模型小鼠血清ALT、AST活性的升高(P<0.001),且呈剂量效应关系。见表1。

2.2GLP对LPS诱导的急性肝损伤小鼠血清IL-1α的影响 与正常组比较,模型组血清IL-1α水平显著升高(P<0.001);与模型组比较,GLP-L、GLP-M、GLP-H组血清IL-1α水平均显著降低(P<0.001),且呈现剂量依赖性。见表1。

2.3GLP对LPS诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA活性的影响 与正常组比较,模型组肝脏中SOD、GSH-Px活性显著降低,MDA活性显著升高(P<0.001);与模型组比较,GLP-L、GLP-M、GLP-H组均能显著抑制LPS诱导的肝损伤模型小鼠肝脏SOD、GSH-Px活性的降低及MDA活性的升高(P<0.001,P<0.01)。见表1。

表1 各组血清ACT、AST活性和IL-1α水平及肝组织中SOD、GSH-Px、MDA活性比较

3 讨 论

肝脏是重要的机体代谢及解毒器官,多种因素可诱发肝损伤,如代谢异常、药物、酒精、病毒及自身免疫性因素;不及时治疗可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等终末期肝病〔7~11〕。肝脏损伤时,首先产生大量的活性氧自由基(ROS),形成氧化应激状态,干扰机体能量代谢。机体内自由基代谢的平衡主要由抗氧化系统调控,包括SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(CAT)等。MDA是脂质过氧化物降解的主要产物,而MDA则间接体现自由基攻击机体时细胞受损的程度。正常情况下,机体内氧化与抗氧化处于动态平衡,外界刺激造成机体内ROS与活性氮自由基(RNS)等表达量增多,同时机体清除能力却下降,因此机体氧化与抗氧化的平衡就受到破坏,形成氧化应激。ROS是以氧为中心的活性基团,包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH),这些活性基团可仅有被催化为过氧自由基(ROO-)、烷氧基(RO-)及硫自由基(RS-),受多种刺激因素机体内堆积大量的未被完全还原的O2进而引发ROS大量激增〔12〕。如酒精刺激,酒精可引起线粒体电子传递链等功能障碍,还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶或活化细胞色素PD459E1(CYP2E1)则可催化分子氧形成大量ROS,进一步抑制脂肪酸氧化,形成酒精性脂肪肝病〔13〕。已有研究发现氧化应激与肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等关系密切〔14〕。

各类因素刺激的ROS激增,不仅造成肝细胞损伤,还可形成脂质过氧化,肝细胞膜脂质过氧化可增加细胞膜的通透性,破坏细胞内膜结构,促进白三烯、血栓素等生物获悉物质产生,进一步诱发炎症反应。肝脏损伤时大量炎症因子释放,几乎所有原因所致肝脏疾病中都存在炎症,而且贯穿疾病的始终,已证实多数肝损伤都伴随炎症〔15,16〕。因此以调控氧化应激和炎症为抓手,针对性治疗肝损伤,可以延缓疾病进展,提高患者生活质量〔17〕。

GLP由三股单糖链沟通,具有螺旋状的三级立体构型,其药理活性与单糖间糖苷链结合形式和立体构型密切相关〔18〕。目前利用紫外可见光谱、红外光谱、气相色谱质谱联用、核磁共振等多项技术已分离获得200余种GLP,对GLP等三旋螺旋梯结构及多糖结构特性进行了全面分析,特别是构效关系也获得了较大进步,构效关系的继续深入研究还有大量工作要完善〔19〕。GLP可有效提高机体免疫力,加速血液微循环,消除体内自由基,提高抗病愈病能力。本研究中发现GLP可有效改善LPS诱导小鼠肝损伤中氧化应激,调控SOD、MDA及GSH-Px活性。肝脏损伤时,转氨酶是肝实质损伤密切相关指标,肝细胞受损则释放转氨酶,转氨酶越高则肝脏损伤越严重。转氨酶种类繁多,如赖氨酸、苏氨酸及其他α-氨基酸均可参与转氨基作用并形成特异性转氨酶,众多转氨酶中ALT和AST最为重要,分别参与催化谷氨酸与丙酮酸间及谷氨酸与草酰乙酸间的转氨作用。本研究结果可见GLP可有效降低LPS诱导肝损伤小鼠血清转氨酶水平,表明GLP可保护肝细胞受损,防止进一步的肝脏损伤。IL是白细胞、免疫细胞间相互作用的主要细胞因子,发挥传递信息,激活或调节免疫细胞,介导T细胞和B细胞的活化、增殖及分化,参与炎症反应。促炎因子IL-1α的活化通常需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1的切割,受炎性小体的调控。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3是最具特征性的炎性小体,其可激活IL-1α的成熟。ROS不仅可以引发氧化应激还能参与炎症级联反应,ROS可激活NLRP3炎性小体,其激活后进一步通过caspase-1导致IL-1α分泌增多,形成ROS-NLRP3-IL-1α的联动模式。因此在进一步研究中,本研究发现GLP可以降低LPS诱导畸形肝损伤小鼠血清炎症因子IL-1α水平,说明GLP通过抑制炎症因子来改善LPS诱导小鼠肝损伤,也进一步验证GLP通过抑制调控ROS-NLRP3-IL-1α的联动模式改善LPS刺激肝细胞损伤。ROS-NLRP3-IL-1α的调控可能有益于GLP对肝损伤的改善作用。综上所述,GLP在抗LPS诱导小鼠肝损伤方面有明显的缓解作用,可以作为保肝护肝的有效功能因子制成保健食品或药物,但具体调控作用机制还需进一步研究。

寻找天然抗氧化剂,降低肝细胞内氧化应激,缓解肝病,对于各类肝病的防治具有重要的研究价值和指导意义。GLP作为众多天然产物中的佼佼者,对肝损伤有较好的治疗效果。相信随着氧化应激的介导肝病相关信号通路的深入研究,将发现GLP改善肝病的特异靶向治疗策略,为GLP临床应用将提供新的策略和思路。

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