老年多发性骨髓瘤患者血小板与淋巴细胞比值、miRNA-181a变化及临床意义

阮云丹 汤艳兰 张星鑫

(1湖北文理学院附属襄阳市中心医院血液肿瘤科，湖北 襄阳 441100；2武汉大学人民医院血液肿瘤科)

多发性骨髓瘤(MM)是源于浆细胞的常见血液系统恶性增殖性疾病，好发于中老年群体，患者可表现出贫血、反复感染、骨破坏、肾功能异常等特征〔1〕。尽管近些年随着免疫调节剂、蛋白酶抑制剂、造血干细胞移植治疗等应用，MM患者总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)有一定延长，但该病仍无法治愈〔2〕。目前报道的MM生存时间从数月到数十年不等，且表现出明显个体差异，尤其是老年MM患者，因脏器功能减退、认知功能下降等原因，在治疗中不良反应大、中断率高，如何精准评估这类人群预后仍是临床关注重点〔3〕。肿瘤发生发展离不开肿瘤微环境，其中以免疫、炎症最突出，血小板与淋巴细胞比值(PLR)作为反映机体免疫、炎症状态的常用指标，被认为与非小细胞肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤发展及预后相关〔4〕。微小RNA(miRNA)作为长度约22个碱基的非编码RNA，可参与机体细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答等生物学过程，与某些肿瘤发生发展关联密切，其中miRNA-181a作为与造血相关的miRNA，目前在血液系统恶性肿瘤研究中受到关注〔5〕。当前国内关于PLR、miRNA-181a与MM关系报道并不多见，本研究通过分析二者在MM患者中表达及与患者临床病理特征、生存时间关系，旨在为MM诊疗及预后判断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年6月至2019年6月襄阳市中心医院收治的MM患者，纳入标准：符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南》(2015年修订)〔6〕中MM诊断标准；初诊患者；于医院接受规范治疗；年龄≥60岁；精神认知良好；可配合随访。排除标准：确诊孤立浆细胞瘤；复发性MM；合并自身免疫性疾病、其他恶性肿瘤、严重感染、营养不良、多器官功能障碍者；因其他血液系统疾病引起的淋巴细胞或血小板异常；参与其他研究者。共129例MM患者设为MM组，年龄60～81〔平均(67.18±4.82)〕岁。同期门诊60例老年健康体检者设为对照组，男34例，女26例，年龄60～79〔平均(66.35±5.06)〕岁。MM组与对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2PLR检测 采集患者入组时(未治疗)肘静脉血3 ml，送检验科检查血常规，采用全自动血液分析仪(日本SYSMEX XE-2100)，计算血小板计数/淋巴细胞计数值，即PLR值。

1.3血清miRNA-181a表达检测 采集入组时肘静脉血标本，4℃、8 917 r/min条件下离心5 min，留取上清液于无菌、无酶EP管，-80℃条件下保存备用。按照血清miRNA快速提取试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)说明提取血清miRNA，参照miRNA first-strand cDNA synthesis Kit试剂盒说明书(上海钰博生物科技有限公司)进行反转录；合成的cDNA作为模板，参照miRNA Real-time PCR试剂盒说明书(上海泽叶生物科技有限公司)进行扩增，采用美国Bio-Rad公司Bio-CFX96定量PCR仪，以U6为内参基因(正义链5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，miRNA-181a引物序列分别为正义链5′-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3′、反义链5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；反应条件：92℃ 35 s，63℃ 35 s，72℃ 45 s，32个循环后，72℃ 延伸10 min。结果于荧光定量操作系统下分析，以2-△△Ct法分析miRNA-181a相对表达量。

1.4其他实验室指标 检测血清标本中与MM相关的其他临床指标，主要包括血清钙、血清白蛋白、血红蛋白、乳酸脱氢酶、肌酐、β2-微球蛋白。

1.5治疗及随访 患者结合肿瘤进展、化疗耐受性、经济条件等进行治疗，采用VD方案(硼替佐米+地塞米松)41例，TD方案(沙利度胺+地塞米松)29例，MP方案(马法兰+泼尼松)10例，VAD方案(长春新碱+阿奇霉素+地塞米松)25例，VDT方案(硼替佐米+地塞米松+沙利度胺)21例、PCD方案(硼替佐米+环磷酰胺+地塞米松)3例。上述治疗中所用药物如下：注射用硼替佐米(正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20183262)；地塞米松(广东南国药业有限公司，国药准字H44024618)；沙利度胺片(常州制药厂有限公司，国药准字H32026219)；马法兰(澳大利亚葛兰素威廉公司，注册证号H20100160)；醋酸泼尼松片(上海上药信谊药厂有限公司，原上海信谊药厂有限公司，国药准字H31020675)；长春新碱(广州白云山明兴制药有限公司，国药准字H44022399)；阿奇霉素(辉瑞制药有限公司，国药准字H10960112)；复方环磷酰胺片(通化茂祥制药有限公司，国药准字H22026738)。2个疗程后评估化疗方案有效性，有效者完成4个疗程后评估疾病情况，无效或进展者更换其他方案治疗。治疗期间随时对患者症状体征、实验室指标进行评估，予以针对性处理。出院后，采取门诊、电话形式进行随访，随访时间截至2020年12月31日。OS定义为疾病确定到死亡或最后随访时间，PFS定义为疾病确诊到疾病进展、复发、死亡或最后随访时间。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件，符合正态分布计量资料采用独立样本t检验；不符合正态分布计量资料用中位数、四分位数间距〔M(P25，P75)〕表示，行Mann-Whitney检验；计数资料行χ2检验；绘制受试者工作特征(ROC)曲线评价PLR、血清miRNA-181a诊断效能，并以约登指数最大时对应PLR、血清miRNA-181a水平确定临界值；采用Kaplan-Meier法行生存分析，Log-rank检验比较生存率。

2 结 果

2.1两组PLR、血清miRNA-181a表达比较 MM组PLR值及血清miRNA-181a表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2PLR、血清miRNA-181a表达对MM诊断价值 以MM为状态变量，以PLR、血清miRNA-181a为检验变量绘制ROC曲线，见表2和图1。

表1 MM组与对照组PLR、血清miRNA-181a 表达比较〔M(P25,P75)〕

2.3PLR值与临床病理关系 根据ROC曲线确定的临界值，将MM患者分为高PLR组(PLR≥140.12)58例，低PLR组(<140.12)71例。结果显示，高PLR组血小板计数明显高于低PLR组(P<0.05)，两组性别、年龄、国际分期系统(ISS)分期、Durie-Salmon(D-S)分期、免疫分型、淋巴细胞计数、血清钙、血清白蛋白、血红蛋白、乳酸脱氢酶、肌酐、β2-微球蛋白比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 PLR、血清miRNA-181a诊断MM的ROC AUC

图1 PLR、血清miRNA-181a诊断MM的ROC曲线

2.4血清miRNA-181a表达与临床病理关系 根据ROC曲线确定的临界值，将血清miRNA-181a表达分为高表达组(miRNA-181a≥1.52)85例，低表达组(<1.52)44例。结果显示，高表达组ISS分期Ⅲ期占比、D-S分期Ⅲ期占比、肌酐、β2-微球蛋白均明显高于低表达组(P<0.05)，淋巴细胞计数、血清白蛋白、血红蛋白均明显低于低表达组(P<0.05)，两组年龄、性别、免疫分型、血小板计数、血清钙、乳酸脱氢酶比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5不同PLR、血清miRNA-181a表达水平患者生存时间比较 截至2020年12月31日，129例患者中位OS为26(2～65)个月，中位PFS为12(1～54)个月。其中高PLR组中位OS为23(2～61)个月，中位PFS为11(1～51)个月；低PLR组中位OS为27(4～65)个月，中位PFS为12(2～54)个月；经Kaplan-Meier分析显示，高PLR组与低PLR组中位OS、中位PFS比较差异均无统计学意义(P=0.074，0.262)。miRNA-181a高表达组中位OS为21(2～52)个月，中位PFS为10(1～49)个月；低表达组中位OS为29(5～65)个月，中位PFS为12(2～54)个月；经Kaplan-Meier分析显示，高表达组中位OS明显低于低表达组(P=0.021)，但高表达组与低表达组中位PFS比较差异无统计学意义(P=0.082)。

表3 PLR值与临床病理关系

表4 血清miRNA-181a表达与临床病理关系

3 讨 论

MM占血液系统恶性肿瘤比例超过10%，且近些年来，随着临床对MM检测及认识进展，老年MM发病人数呈逐年上升趋势，尽管目前相关新药研究取得一定进展，但受老年患者身体功能影响，不少新药应用并未在老年人群中显示生存获益〔7〕。MM发病机制复杂且有异质性，目前关于其病理机制研究主要集中于细胞遗传学和骨髓微环境分析，其中炎症和免疫作为骨髓微环境基本特点也是临床关注重点〔8〕。

PLR值是临床评价炎症与免疫状态的常用指标，目前被认为与多种恶性肿瘤发展和预后相关〔9〕。本研究显示，MM组PLR值较对照组明显升高，这与崔壮壮等〔10〕报道一致。本文提示PLR值升高可能与MM发生相关。分析原因，PLR值升高，无非与血小板数量过度增加或淋巴细胞计数明显下降有关。一方面，血小板作为血细胞重要成分，在正常情况下主要参与机体凝血、止血，但在病理状态下，可释放转化生长因子、血管内皮细胞因子等活性因子，参与炎性反应，诱导肿瘤细胞增殖、血管生成，为肿瘤生长、转移创造有利条件；而MM肿瘤细胞也能通过释放大量细胞因子，刺激骨髓巨核细胞向血小板分化、诱导血小板聚集，二者相互作用使得病情进一步发展〔11〕。另一方面，淋巴细胞数量及功能与机体免疫状态息息相关，可通过直接细胞毒作用、抑制血管生成等作用产生抗肿瘤效应，但受各种因素影响引起机体免疫状态改变时，淋巴细胞可随之出现数量或功能变化；而且MM肿瘤细胞本身及其细胞因子也可对机体正常免疫功能产生抑制，使得淋巴细胞数量及亚群出现改变，机体抗肿瘤效应减弱，导致肿瘤进一步发展，因此淋巴细胞计数也影响着MM预后，这也是免疫调节剂在抗MM治疗中往往能发挥良好作用的原因〔12〕。故MM患者可表现出PLR值升高。本研究提示虽然MM患者可表现出PLR值升高，但PLR值升高并不是导致患者病情进展或发生肾损伤、贫血、高钙血症等病理变化的决定性因素。本研究提示，PLR值对MM患者预后影响并不明显，但既往有研究认为〔13〕，高PLR可能意味着初诊MM患者较短的生存时间，与本研究有一定差异，可能与研究样本量、治疗方案等差异有关，而且PLR作为一个动态指标，本身受多种因素影响，后期可扩大样本量、采用多中心研究进一步评估PLR对MM预后影响。

近些年来，循环miRNA与恶性肿瘤的发生及预后的研究越来越多，研究认为〔14〕，miRNA可通过介导细胞因子表达、影响细胞周期信号通路等途径参与肿瘤细胞调控，有促进肿瘤细胞凋亡或增殖的作用。miRNA-181是一个家族系列miRNA，主要在人类1、9、19号3个独立染色体上编码，可通过与靶目标mRNA的3′-UTR碱基互补结合来降低互补mRNA稳定性或抑制其翻译功能，从而调控相关基因表达，参与各种生理、病理过程〔15〕。miRNA-181a作为miRNA-181家族重要成员之一，被认为与造血功能相关，研究显示〔16〕，miRNA-181a在急性白血病中呈高表达，且与患者预后关联密切。本研究提示血清miRNA-181a高表达可能参与MM发生，且对MM有一定诊断价值。不过目前关于miRNA-181a表达影响MM发生的机制并不明确，有研究认为〔17〕，miRNA-181a可能通过抑制凋亡蛋白表达，使得肿瘤细胞抗凋亡作用增强，利于肿瘤发展；还有文献显示〔18〕，miRNA-181a的靶基因P300/CBP相关因子在多数MM细胞株中表达明显缺损，且伴随着miRNA-181a高表达，MM细胞凋亡率也下降，认为miRNA-181a可能是MM致癌因子之一。ISS分期、D-S分期是目前临床评价MM病情的常见分期方式，可用于患者生存期评估；血清白蛋白、血红蛋白、肌酐、β2-微球蛋白等指标与患者贫血、肾功能损害等病理特征有关；一般来说，ISS分期、D-S分期越晚，血清白蛋白、血红蛋白越低，肌酐、β2-微球蛋白越高，提示肿瘤负荷越重，患者预后也越差〔19〕。本研究说明miRNA-181a与患者病情进展及不良预后有关，可能因为miRNA-181a高表达能干扰磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路而影响肿瘤细胞周期，有利于促进肿瘤细胞增殖与迁移〔20〕；也可能与miRNA-181a高表达诱导肿瘤细胞耐药性有关〔21〕；具体机制仍有待研究。本研究提示miRNA-181a高表达可能意味着更短的生存期，这一结果或许可为后期MM精准预后评估、miRAN靶向治疗奠定基础，但仍有待大样本、多中心研究证实。

综上，老年MM患者外周血PLR值升高、血清miRNA-181a呈高表达，且与部分临床病理特征有关，尤其是血清miRNA-181a高表达，可能意味着患者更差的预后及更短的生存时间，可为患者诊疗、预后评估带来契机。