阿柏西普对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用及其机制研究△

孙 浩 李 姣 毕宏生 王兴荣

恶性黑色素瘤是人类致死率很高的肿瘤之一，最早由希波克拉底提出[1]。葡萄膜黑色素瘤是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，占眼内黑色素瘤的 83.0%，极易发生转移，常见的为肝转移，其次是肺转移和骨转移，如果在肿瘤发生全身转移前进行诊断和治疗，患者存活率可提高到90.0%[2]。众所周知，人血管内皮生长因子(VEGF)是影响血管生成的主要因子之一，异常的血管生成与肿瘤的生长、转移密切相关[3]。研究发现，阻断 VEGF的产生并抑制肿瘤新生血管形成被认为是一种有效的抗肿瘤治疗方法[4]。阿柏西普是一种抗VEGF的眼内注射药物，是由 VEGF的受体1、受体 2 与人免疫球蛋白 Fc片段重组形成的融合蛋白,可通过特异性地结合VEGF-A所有亚型和胎盘生长因子(PLGF)等VEGF 家族成员及促血管生成细胞因子，从而抑制 VEGF家族成员与天然VEGF受体的结合与激活，减少血管内皮细胞分裂、增殖，降低血管通透性,进一步抑制新生血管的生成[5]。在转移性结肠癌患者肿瘤模型中，阿柏西普可以使肿瘤的脉管系统及体积减小，抑制腹水生成[6]。因此我们推测，阿柏西普可以通过拮抗VEGF的某个受体，从而抑制葡萄膜黑色素瘤的生长。本实验主要研究抗VEGF 药物阿柏西普对葡萄膜黑色素瘤B16F10细胞生长的影响和靶向机制，揭示阿柏西普在UM治疗过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料葡萄膜黑色素瘤细胞株B16F10(中国科学院细胞库);阿柏西普(美国拜耳公司)；胎牛血清(FBS；澳大利亚GICO公司)；高糖-DMEM 培养液(美国Hyclone公司)；PBS试剂、CCK-8试剂盒和PCR试剂盒均购自山东思科捷生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物有限公司合成；ELISA试剂盒购自上海将来实业股份有限公司；流式细胞仪试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。裂隙灯显微镜(德国 Zeiss)；高倍显微镜(美国 Leica-M841型)；高速冷冻离心机(美国 Heal Force)；流式细胞仪(美国 BD FACSVerse)；快速温度梯度PCR仪(美国 Bio-RAD)；荧光定量PCR反应机(德国罗氏480)；酶联免疫仪(美国 BioTek)；细胞培养箱(上海新苗)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将购买的葡萄膜黑色素瘤B16F10细胞用含体积分数10%FBS、100 mg·L-1链霉素、100×103U·L-1青霉素的高糖-DMEM培养基进行培养，置于37 ℃、含体积分数5% CO2细胞培养箱中培养。当培养瓶中细胞占据90%～100%时，用0.5 g·L-1胰蛋白酶进行消化、传代，本实验所用的细胞为第3-6代。

1.2.2 RT-CES动态监测各组细胞生长状态将10×103个B16F10细胞分别种植于16孔板中，在37 ℃、含体积分数5% CO2细胞培养箱中培养20 h，去除培养液，实验组按加入药物浓度不同设为0.2 g·L-1阿柏西普组、2.0 g·L-1阿柏西普组、4.0 g·L-1阿柏西普组，各实验组细胞加入不同浓度阿柏西普与DMEM混合的培养液继续培养，对照组细胞加入等量DMEM培养液继续培养。利用 RT-CES 分析器记录并分析各组细胞经不同浓度阿柏西普干预90 h内的生长趋势。

1.2.3 CCK-8法检测各组细胞生存率将B16F10细胞按每孔10×103个接种于96 孔板内，置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中培养24 h，实验组细胞用含不同浓度(0.2 g·L-1、2.0 g·L-1、4.0 g·L-1)的阿柏西普与 DMEM 混合的培养液继续培养，对照组细胞加入等量DMEM培养液继续培养，每组设置3个复孔。继续培养24 h后，每孔加入200 μL CCK-8 检测试剂，培养4 h后检测各组细胞在490 nm 波长下的吸光度(D)，计算细胞生存率。细胞生存率(%)=(D实验组/D对照组)×100%。

1.2.4 RT-PCR检测各组细胞中VEGF-A mRNA的相对表达量利用RT-PCR检测B16F10细胞经阿柏西普干预后VEGF-A mRNA的表达。提取总RNA后采用Takara逆转录试剂盒逆转录合成 cDNA,VEGF-A 的引物序列如下：上游引物为5’-GCCCTTGCCTTGCTGCTCTACC-3’，下游引物为5’-GTGATGATTCTGCCTCCTCCTTC-3’。以β-actin作为内参照行 PCR 扩增。反应条件为:95 ℃ 3 min预变性；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40 个循环，然后 95 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s。按2-ΔΔCt计算各组细胞中VEGF-A mRNA的相对表达水平。

1.2.5 ELISA检测各组细胞中VEGF-A含量将实验组B16F10细胞分别用0.2 g·L-1、2.0 g·L-1、4.0 g·L-1阿柏西普与DMEM的混合培养液进行处理，对照组细胞加入等量DMEM培养液培养。24 h后收集每孔上清液200 μL，利用VEGF-A ELISA试剂盒进行分析，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 各组细胞周期检测将B16F10细胞培养至对数生长期，在生长状态良好的情况下进行实验。细胞经 PBS 清洗、胰蛋白酶消化计数后稀释至 60×103个·mL-1，然后将其吹打混匀，取5 mL 按每瓶300×103个细胞接种于6孔板上，置于37 ℃、含体积分数5%CO2饱和湿度细胞培养箱内培养 24 h。0.2 g·L-1、2.0 g·L-1、4.0 g·L-1阿柏西普分别加入实验组对应培养板内，对照组加入等量DMEM培养液，置于细胞培养箱继续培养48 h。连同培养上清液一起收集阿柏西普作用 48 h后的细胞，1000 r·min-1离心5 min，用PBS清洗一遍，再用体积分数70%冰乙醇4 ℃固定12 h以上。将固定好的细胞离心去除乙醇，预冷PBS清洗2遍后，0.5 mL预冷的PBS 重悬细胞。分别加入5 μL的10 g·L-1RNaseA，对不同浓度阿柏西普作用后的细胞于37 ℃避光处理30 min。再用0.05 g·L-1碘化丙啶于4 ℃避光处理30 min。利用流式细胞仪对处理好的各组细胞进行细胞周期检测。

1.2.7 细胞凋亡检测将B16F10细胞培养至对数生长期，细胞经 PBS 清洗、胰蛋白酶消化计数后稀释至 30×103个·mL-1，然后将其吹打混匀，取5 mL以每孔150×103个接种于6孔板中，于 37 ℃、含体积分数5%CO2饱和湿度细胞培养箱内培养24 h。分别取0.2 g·L-1、2.0 g·L-1、4.0 g·L-1阿柏西普加入对应实验组孔内，对照组加入等量DMEM培养液，将孔板置于37 ℃、含体积分数5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养48 h。连同培养上清液一起收集，1000 r·min-1离心5 min，PBS清洗。先用500 μL AnnexinV/FITC binding buffer 重悬细胞，再分别依次加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶，避光处理15 min。将处理好的细胞用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

2 结果

2.1 各组细胞生长状态RT-CES连续监测阿柏西普作用B16F10细胞90 h的生长状态曲线显示：与对照组相比，4.0 g·L-1阿柏西普组细胞的生长受抑制作用最明显，2.0 g·L-1阿柏西普组与对照组相比细胞生长受抑制较明显，0.2 g·L-1阿柏西普组与对照组相比细胞生长受抑制作用不明显(图1)。

2.2 各组细胞的生存率随着时间的推移，B16F10细胞经过不同浓度阿柏西普处理后发现，实验组细胞相较于对照组具有明显的抗细胞增殖活性，其中48 h检测结果提示细胞生存率下降最为明显，0.2 g·L-1、2.0 g·L-1、4.0 g·L-1阿柏西普组细胞生存率分别为(95.10±1.76)%、(87.33±2.20)%和(74.36±1.67)%，且表现出浓度和时间依赖性。

2.3 各组细胞中VEGF-A mRNA的相对表达量RT-PCR检测结果显示，对照组细胞中VEGF-A mRNA的相对表达量为1.00±0.03，4.0 g·L-1阿柏西普组细胞中VEGF-A mRNA相对表达量(0.70±0.05)较对照组下调，0.2 g·L-1阿柏西普组、2.0 g·L-1阿柏西普组细胞中VEGF-A mRNA表达较对照组均下调，相对表达量分别为0.73±0.03、0.82±0.01，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.4 各组细胞中VEGF-A含量ELISA检测结果表明，阿柏西普干预B16F10细胞24 h后，对照组细胞中VEGF-A含量为(97.84±0.76)ng·L-1；0.2 g·L-1阿柏西普组、2.0 g·L-1阿柏西普组、4.0 g·L-1阿柏西普组作用24 h后，B16F10细胞VEGF-A含量分别下降为(85.50±0.88)ng·L-1、(62.70±0.19)ng·L-1、(43.11±0.17)ng·L-1，与对照组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.5 各组细胞周期结果阿柏西普对B16F10细胞作用24 h后，对照组与0.2 g·L-1阿柏西普组、2.0 g·L-1阿柏西普组、4.0 g·L-1阿柏西普组G1期和G2期的细胞比例比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；各组间S期细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示，阿柏西普可以引起B16F10细胞S期阻滞，从而抑制细胞周期性增殖(表1)。

2.6 流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果对照组培养24 h后正常细胞比例为96.34%,破碎、坏死细胞的比例为2.51%,凋亡细胞的比例为0.00%。0.2 g·L-1、2.0 g·L-1、4.0 g·L-1阿柏西普组处理细胞24 h后，正常细胞比例显著下降，分别为90.53%、72.36%、67.40%，凋亡细胞的比例明显上升，分别为3.51%、11.10%、14.77%。结果表明，阿柏西普可以促进B16F10细胞的凋亡，并呈浓度依赖性(图2)。

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况 A：对照组；B为0.2 g·L-1阿柏西普组；C：2.0 g·L-1阿柏西普组；D：4.0 g·L-1阿柏西普组。

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤是成人常见的眼内恶性肿瘤，早期无明显症状，容易漏诊和误诊，且恶性程度高，易侵袭转移，一旦转移预后极差[7]。目前，葡萄膜黑色素瘤的治疗主要包括眼球摘除术、局部肿瘤切除术、局部放射治疗(巩膜外敷贴放射治疗、立体放射治疗、质子束治疗)和激光光凝治疗(经瞳孔温热疗法、光动力疗法)[8]。虽然治疗方法有所改善，但疗效各异。迄今为止，还没有一种较为理想的治疗方法。众所周知，葡萄膜黑色素瘤细胞的高增殖活性和极易发生眼外转移是导致该肿瘤诊疗困难及死亡率高的主要原因[9]。肿瘤的生长、发育及转移均依赖血管提供必需的营养物质，运走代谢废物。肿瘤新生血管不仅能为组织提供日常代谢的营养，并且为肿瘤细胞进入循环系统向远处转移提供了途径[10]。基于此，如果能成功阻断或抑制肿瘤血管的新生，切断其营养通路，肿瘤细胞最终将停止增殖而死亡，以此来达到治疗肿瘤的目的，这也正是享有盛誉的抗肿瘤血管生成疗法[11]。

迄今研究认为，抗VEGF药物也是抑制肿瘤的药物，目前阿柏西普作为一种抗VEGF的眼内注射药物，广泛应用于湿性黄斑变性、黄斑水肿等眼病的治疗，并取得了良好的疗效，但其对于治疗葡萄膜黑色素瘤是否依然有效目前尚不明确，并且国内的相关研究报道也不多。葡萄膜黑色素瘤细胞发育过程可以表达更多的VEGF，而肿瘤细胞的生长也依赖VEGF[12]。VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和PLGF，在新生血管形成过程中是不可或缺的关键因子，通过刺激血管内皮细胞的有丝分裂和迁移诱导血管形成[13]。阿柏西普是由VEGF受体(VEGFR)胞外结构域(VEGFR1-Ig2区和VEGFR2 Ig3 区)与人免疫球蛋白G1的Fc片段相结合的一种重组蛋白，具有半衰期长、与 VEGF-A 受体亲和性高及抑制新生血管形成等特征[14-15]。阿柏西普作为VEGF的可溶性诱饵受体，可与VEGF-A的所有亚型、VEGF-B及PLGF结合，阻断肿瘤组织中新生血管形成，从而间接达到抗肿瘤的目的[16]。研究表明，阿柏西普与所有VEGF-A亚型的亲和力大于 VEGF-A 与其自身受体的亲和力，可有效防止VEGF 结合并激活其受体[17]。

本研究采用几种细胞生物学技术探究了阿柏西普对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响。实时细胞检测系统RT-CES可以连续记录分析葡萄膜黑色素瘤细胞生长的全过程，描绘阿柏西普干预后90 h内的细胞生长曲线，提供了大量的动态反应信息，结果显示，4.0 g·L-1阿柏西普干预B16F10细胞效果最为明显。CCK-8法检测结果发现，阿柏西普可显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的活力，且呈剂量和时间依赖性。ELISA检测结果提示，阿柏西普干预葡萄膜黑色素瘤细胞24 h后，能够呈浓度依赖性地抑制细胞中VEGF-A的表达。RT-PCR检测结果发现，高浓度剂量组的阿柏西普可以明显下调细胞中VEGF-A mRNA的表达，并且流式细胞仪检测结果显示，阿柏西普呈剂量依赖性地诱导葡萄膜黑色素瘤细胞发生凋亡和S期阻滞。因此可以推断，阿柏西普可能是通过下调B16F10细胞中VEGF-A mRNA的表达来抑制VEGF-A的分泌，然后通过VEGF-A来拮抗VEGF，从而达到抑制葡萄膜黑色素瘤细胞生长并且诱导其发生凋亡的目的。

综上所述，阿柏西普可诱导葡萄膜黑色素瘤细胞发生凋亡和S期阻滞，这可能与其抑制VEGF-A的分泌和VEGF-A mRNA的表达有关。本研究为进一步开发阿柏西普的抗肿瘤作用提供了新的证据支持，但不同剂量的阿柏西普对葡萄膜黑色素瘤细胞的安全性研究有待进一步开展。