汤汁辅料对腐乳发酵过程中单胺氧化酶活性及生物胺积累的影响

赵 丹， 罗俏俏， 王 欣， 王成涛，*

(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心， 北京 100048；2.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心， 北京 100048)

腐乳与豆豉、酱油、豆酱并称我国四大传统发酵豆制品、发酵调味品[1-2]。腐乳已有一千余年的历史[3]，其味道鲜美、质构细腻、营养丰富。在我国，腐乳的生产遍布南北各地，因添加配料不同，规格大小不一，品种与名称繁多。各地腐乳的制作原理和发酵过程大致相同，即在一定环境条件下，豆腐坯经自然或人工接种微生物，产生蛋白酶、脂肪酶等丰富高活性酶系，大豆蛋白酶解为鲜味氨基酸、呈味肽等，汤汁辅料中微生物发酵转化为低分子醛、酮、酯等，形成腐乳的特征香气和滋味成分[4]。

高盐含量是中国传统发酵腐乳的重要特征。研究发现，高盐饮食与高血压、心脏病、肾脏疾病和脑出血的诱发有直接关系[5]，因此传统发酵腐乳的低盐化已成为发酵豆制品行业的发展趋势。由于食盐在腐乳发酵和贮藏过程中可抑制腐败菌、致病菌的生长与存活，具有调味、助鲜等作用[6-7]，因此腐乳低盐化面临着诸多挑战，尤其是在保障食品安全性及独特风味形成方面。

腐乳发酵产生的大量游离氨基酸是其特征风味成分。腐乳发酵微生物的氨基酸代谢过程中，氨基酸经脱羧酶催化脱羧反应生成生物胺[6-7]。腐乳中可能含有组胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、β-苯乙胺、精胺和亚精胺等生物胺，其中组胺、酪胺被认为安全风险性较高[7-9]，食用含过量组胺的食物可造成食物不耐受，甚至可致食物中毒、偏头痛[8-9]；食用富含过量酪胺的食品，会增加高血压风险，也可导致偏头痛[8-10]。腐乳中的生物胺已成为威胁大众健康的潜在风险因素，同时也是制约腐乳产业发展的重要因素。

近年来，关于发酵豆制品、黄酒等食品中的生物胺形成与调控已有一些报道[9-13]。这些研究发现，发酵食品中生物胺的生成需要满足一定条件，即存在底物游离氨基酸、氨基酸脱羧酶及其产酶微生物，且具备并存的环境因素[9-11]。Chin等[10]研究不同盐含量面酱发酵过程中生物胺的变化，发现3.5%～5.5%的食盐可抑制组胺生成；Jia等[11]研究构建适宜微生物群落，并将其应用于降盐豆瓣酱发酵；Zhao等[12]发现，接种发酵剂肉状葡萄球菌、乳酸小球菌，对减少蚕豆酱发酵过程中生物胺的形成，效果良好；马艳丽等[6,13]认为，在腐乳后酵汤料中添加乳酸菌可有效抑制生物胺增加，腐乳开盖后不同贮藏温度下青方腐乳生物胺含量与pH值呈正相关；Li等[14]研究表明，生姜粉等香辛料可抑制细菌生长、降低生物胺含量。邢旋等[15]研究发现，添加强化戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)M28，可显著降低黄酒中生物胺含量。

腐乳发酵过程中产生的生物胺，可通过单胺氧化酶降解生成乙醛、氨和过氧化氢[16]，因此提高单胺氧化酶活力，有利于减少腐乳发酵过程中生物胺的积累[17]。腐乳中单胺氧化酶主要来源于前发酵接种的毛霉和环境微生物，后发酵过程中汤汁微生物生长及分泌，尤其后发酵过程中汤汁辅料决定了其微生物群落演替和相关酶系活性变化，进而影响了腐乳中生物胺的降解与积累。目前，影响腐乳发酵过程中生物胺积累的因素及动态变化规律尚缺乏深入研究。本研究拟探讨腐乳汤汁辅料中食盐、酒精与pH值对腐乳发酵过程中单胺氧化酶活性及生物胺积累的影响，解析其动态变化规律，以期为低盐化腐乳开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆腐坯、雅致毛霉，绍兴咸亨食品股份有限公司。精制碘盐、柠檬酸、乳酸、食用酒精、香辛料、红曲粉，市售。丹磺酰氯、氢氧化钠、碳酸钠、生物胺标准品等其他试剂均为国产分析级。

1.2 仪器与设备

LC- 20AT型高效液相色谱仪，日本岛津公司；Alpha 2- 4 Ldplus型真空冷冻干燥机，德国CHRIST冻干机有限公司；SL- 650D型超声波细胞破碎仪，南京顺流仪器有限公司；恒温水浴锅，山东华鲁电热仪器有限公司；SpectraMax 13型连续波长多功能酶标仪，美国Molecular Devices；PH400型精密pH计，安莱立思仪器科技(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1腐乳样本制备

1)腐乳前发酵。在PDA平板上，于26 ℃培养毛霉48～72 h，灭菌蒸馏水冲洗过滤制备孢子悬液。将切块均匀的豆腐坯(3 cm×3 cm×1 cm)码放在笼屉内，前后左右间距1 cm左右，毛霉孢子悬液均匀喷洒于豆腐坯表面，恒温培养箱温度26 ℃，空气湿度85%～95%，培养72 h，培养至白色菌丝包围豆腐坯，凉花30 min后搓毛，制成腐乳毛坯。

2)腐乳后发酵。将毛坯分两层均匀码放于玻璃瓶中，灌入发酵汤料，用少量酒精擦拭封口进行后发酵。在传统腐乳制备工艺基础上，本研究改良了腐乳制备工艺：毛坯未经分层撒盐腌制过程，直接灌入发酵汤料，于18～22 ℃进行后发酵。发酵汤料配方为香辛料粉质量分数1%、红曲粉质量分数2%～4%，并通过控制食盐、食用酒精、柠檬酸添加量，调节发酵汤汁的盐含量、酒精含量与pH值。

1.3.2汤汁辅料腌制条件的设定

1)研究pH值对腐乳后发酵过程影响时，汤汁中食盐的质量分数为7%、酒精的体积分数为15%，pH值为4.5、5.0、5.5；2)研究食盐对腐乳发酵过程影响时，汤汁中酒精的体积分数为15%、pH值为5.5，盐的质量分数为3%、5%、7%；3)研究酒精对腐乳发酵过程影响时，汤汁中食盐的质量分数为7%，pH值为5.5，酒精的体积分数为15%、20%、25%，将盐质量分数为7%、酒精体积分数为15%、pH值为5.5的腐乳汤汁作为对照组，该条件是传统腐乳生产常见发酵条件。

1.3.3腐乳后发酵过程中单胺氧化酶活力检测

根据生物胺氧化酶活力的定义：以混合生物胺为底物，1 min引起吸光值(ΔOD470)变化0.01所需要的酶量为一个酶活单位，U。参照文献[16]检测单胺氧化酶的活性。称取2 g充分研磨的腐乳样品置于7 mL离心管中，加入4 mL预冷PBS(0.1 mol/L、pH值为7.0)，漩涡震荡15 min，离心取滤液进行破碎。通过超声波细胞破碎仪进行冰浴超声破碎30 min(破碎5 s，间隔5 s)，破碎功率为500 W，吸取上清液即为单胺氧化酶提取液。

1.3.4腐乳中生物胺含量的测定

样品前处理：腐乳样品冻干72 h并粉碎成粉，取1 g冻干腐乳粉于50 mL离心管中，然后加入10 mL 0.1 mol/L HCl，用16 000 r/min搅拌分离器均质1 min，8 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液备用。采用柱前衍生高效液相色谱法进行测定，衍生方法参照文献[17]的方法，采用丹磺酰氯柱前衍生法。

高效液相色谱检测条件[17]：色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱温箱40 ℃，流速1 mL/min，进样量20 μL，紫外检测器254 nm，流动相0.1 mol/L乙酸胺缓冲溶液(A相)，乙腈纯溶液(B相)；梯度洗脱程序见表1。

图1 不同汤汁辅料的腐乳发酵过程中单胺氧化酶活力的变化Fig.1 Changes of monoamine oxidase activity in Sufu with different soup accessories during fermentation

表1 梯度洗脱程序

混合标准曲线的制作：精确称取组胺、色胺、酪胺、腐胺、尸胺五种生物胺标准品各50 mg，用0.1 mol/L HCl溶解，定容至50 mL，制备成生物胺标准储备液待用。将储备液用0.1 mol/L的HCl配制成生物胺质量浓度分别为500、380、250、100、50、30、10、5 μg/mL的混合标准溶液。衍生结束后，用0.45 μm微孔滤膜过滤，经高效液相分析后以各生物胺质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4 数据处理

各检测指标均进行3次重复检测，采用OriginPro 2018软件对数据进行处理并绘图，采用独立样本T检验确定数据间的差异性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 汤汁辅料对腐乳后发酵过程中单胺氧化酶活力的影响

食盐、酒精、pH值对腐乳后发酵过程中单胺氧化酶活力的影响，实验结果见图1。由图1(a)可见，食盐质量分数为3%～7%，发酵初期(前30 d)单胺氧化酶活性呈下降趋势，发酵中后期(40～80 d)活力回升。按食盐质量分数排序，单胺氧化酶活力从大到小依次为7%组、5%组、3%组，且盐的质量分数为7%组酶活力显著高于其余两组(P<0.05)，提示后发酵过程中微生物可分泌单胺氧化酶，且相对高盐环境有利于保持单胺氧化酶稳定性。这可能与在低盐环境下，腐乳发酵过程中的微生物更易代谢产酸，从而抑制单胺氧化酶的产酶量与活力有关。图1(b)中，15%酒精组的单胺氧化酶活力高于其余两组(P<0.05)，说明高酒精含量可能对单胺氧化酶活力产生了抑制作用。图1(c)中，不同pH值条件下，单胺氧化酶活性基本呈现发酵初期下降、中后期活力回升趋势，说明发酵微生物提高了单胺氧化酶活力；发酵后期，pH值越低，腐乳单胺氧化酶活力越低，说明低酸环境降低酶解活力，这一结果与杨春艳[16]的研究中认为单胺氧化酶是一种碱性酶的推论一致。

2.2 汤汁辅料对腐乳后发酵过程中生物胺积累的影响

2.2.1食盐的影响

采用高效液相色谱法分别测定了腐乳后发酵过程中不同种类生物胺含量，分析汤汁中食盐对生物胺积累的影响(图2)。由图2可见，在不同食盐浓度下，腐乳后发酵过程中生物胺总量及组胺、色胺、腐胺含量基本呈先升高的趋势，其中组胺积累量随后发酵过程逐渐升高趋势更为明显，尸胺积累量呈现逐渐减少趋势，酪胺含量低且较稳定。发酵20 d后各实验组组胺均呈现升高趋势，尤其食盐质量分数为3%、5%组，组胺升高趋势显著高于其余组(P<0.05)；而3%、5%食盐组，色胺和腐胺积累量均持续上升，7%食盐组的色胺和腐胺积累量持续下降。3%食盐组生物胺积累总量尤其突出，达到13.2 mg/g，其中组胺积累量高达8.2 mg/g，表明低盐浓度下，腐乳中生物胺积累量升高，说明腐乳降盐后需要考虑生物胺升高的风险。结合图1(a)分析，发酵30 d后，7%食盐组单胺氧化酶活力持续升高，且显著高于3%、5%食盐组，表明单胺氧化酶对组胺、色胺、腐胺等不同生物胺的降解活力作用是不同的，这是导致不同种类生物胺含量差异的原因。

图2 添加不同质量分数食盐的腐乳发酵过程中生物胺积累量的变化Fig.2 Changes of biogenic amine content during fermented processing of Sufu with different mass fractions of salt

2.2.2酒精的影响

图3为汤汁中酒精对腐乳发酵过程中生物胺积累量影响的实验结果。图3表明，在后发酵过程中，15%～25%酒精浓度腐乳样品中生物胺总量基本呈现先升高后降低的趋势。腐乳样品中组胺为主要生物胺组分，酪胺含量最低，这与Qiu等[18]的研究结果一致。分析发酵80 d时腐乳样品的生物胺含量，高酒精浓度可抑制生物胺积累，当酒精体积分数大于20%时，对腐乳中腐胺、组胺、尸胺的生成抑制作用显著；15%酒精组的样本中色胺含量最低，结合图1(b)分析，这可能与15%酒精组的单胺氧化酶活力高，加速了色胺降解有关。

图3 添加不同体积分数酒精的腐乳发酵过程中生物胺积累量的变化Fig.3 Changes of biogenic amine content during fermented processing of Sufu with different volume fractions of alcohol

2.2.3pH值的影响

图4为不同pH值条件下腐乳中生物胺含量变化情况。由图4可见，在腐乳后酵过程中生物胺总量及其不同种类生物胺量基本呈现先升高后降低的趋势，其中pH值为 4.5组和pH值为 5.0组，在发酵20 d时生物胺总量呈现峰值，峰值出现时间早于pH值为 5.5组；pH值为5.5组，发酵45 d时出现峰值，且其峰值更高(达到6.8 mg/g)。从生物胺种类看，腐乳发酵积累的生物胺主要为组胺和色胺，发酵80 d时其质量分数分别达到1.55、1.58 mg/g。结合图1(c)分析，pH值为5.5组腐乳中单胺氧化酶活力最高，而该条件下生物胺积累量最高，表明低pH值环境对生物胺积累的抑制作用远大于单胺氧化酶的降解作用。发酵80 d时，pH值5.5组的色胺含量显著低于其余两组(P<0.05)，说明酸性环境对色胺无抑制作用或微生物发酵改变了汤料pH值，抑制了产生物胺微生物生长繁殖及生物胺积累。

图4 不同pH值的腐乳发酵过程中生物胺积累量的变化Fig.4 Changes of biogenic amine content during fermented processing of Sufu with different pH values

2.3 不同食盐浓度汤汁的腐乳发酵过程中生物胺积累量与降盐策略分析

图5 不同食盐、酒精浓度和pH条件下腐乳发酵过程中生物胺积累量的变化Fig.5 Changes of biogenic amine accumulation in Sufu fermented processing under different concentration of salt, alcohol and pH value

根据单因素实验的研究结果，进一步分析汤汁食盐质量分数3%～7%与调节不同pH值、酒精浓度配合时，腐乳后发酵生物胺积累量的变化，实验结果见图5。图5(a)中，当食盐质量分数为3%时，pH值为4.5与酒精体积分数为25%的组，发酵过程中生物胺积累量显著低于其余两组(P<0.05)；图5(b)中，当食盐质量分数为5%时，pH值为4.5与酒精体积分数为25%的组，发酵前20 d生物胺积累更迅速，其余两组20～45 d积累更快；图5(c)中当食盐质量分数为7%时，pH值为4.5与酒精体积分数为25%的组，发酵前20 d生物胺积累量迅速达到峰值，显著早于其余两组到达峰值的时间。这些现象表征了腐乳后发酵过程中微生物演替及其单胺氧化酶对生物胺积累与降解的影响。

比较图5中发酵80 d结束时各实验组生物胺积累量，当pH值为5.5与酒精体积分数为15%时，7%、5%和3%食盐组样品中生物胺积累量分别为4.86、6.62、13.15 mg/g；当pH值为4.5与酒精体积分数为25%时，7%、5%和3%食盐组样品的生物胺积累量分别为3.25、4.83、10.54 mg/g。研究结果表明，在相同食盐浓度时，提高汤汁酒精浓度，降低其pH值有利于减少生物胺积累；腐乳降盐后增加了生物胺积累的风险，降盐的同时通过提高汤汁酒精浓度，降低pH值等综合措施有利于降低生物胺积累的风险，因此开发低盐化腐乳，降盐的同时需要结合其他综合措施消除食品安全风险。马艳丽等[6,13]发现，腐乳后酵汤料添加乳酸菌可有效抑制生物胺积累；Zhao等[12]接种肉状葡萄球菌、乳酸小球菌，可减少蚕豆酱发酵过程中生物胺形成，效果良好。类似综合措施可应用于低盐化腐乳开发，该方面尝试有待深入开展。

3 结 论

本研究探讨了汤汁辅料对腐乳发酵过程中单胺氧化酶活力及生物胺积累的影响。实验结果表明：腐乳发酵过程中单胺氧化酶活性与生物胺积累量呈现显著负相关性，腐乳汤汁的食盐、酒精及pH值影响腐乳产品的生物胺积累及其组胺、色胺、腐胺、尸胺等种类组成，其中组胺、色胺为腐乳的主要生物胺组分，酪胺含量很低；在相同食盐浓度时，提高汤汁酒精浓度、降低pH值有利于减少腐乳产品生物胺含量。在汤汁中食盐质量分数为3%～7%、酒精体积分数为15%～25%、pH值为4.5～5.5时，腐乳发酵前30 d呈现单胺氧化酶活性下降，发酵中后期(40～80 d)活性回升。生物胺总量及组胺、色胺积累量呈现先升高，45 d后逐渐降低趋势；发酵20～45 d时，生物胺积累总量呈现峰值，基本维持在6.5 mg/g以下，以后逐渐降低；发酵80 d结束时，各组腐乳中生物胺积累量均为2.0～4.8 mg/g，组胺和色胺积累量为0.6～1.8 mg/g，但3%食盐组生物胺积累较高。本研究表明，低盐化腐乳开发，降盐的同时需要配合提高酒精浓度、降低pH值的综合措施，以提高其食品安全性及风味品质。