小蓟多糖—诺米林复合涂膜剂制备工艺的优化及对柠檬果实贮藏品质的影响

黎春红，邱铃岚，雷长毅，汪开拓

(重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 万州 404000)

【研究意义】柠檬[Citruslimon(L.)Burm. F.]为芸香科柑橘属常绿小乔木，其果实风味浓郁，含多种维生素、矿物质等微量元素及橙皮苷、黄酮、苦素等功能性物质，极具营养和保健价值[1]。柠檬鲜果通常于秋季集中上市，春夏季节成熟果实的供给量不足，存在供应断档期的问题[2]。低温贮藏可显著降低柠檬鲜果采后病害发生率并延长供应档期，但柠檬鲜果表皮或机械伤口处潜伏的褐腐疫霉菌(Phytophthoracitrophthora)孢子仍能在低温环境中萌发并侵染邻近果实，从而导致果实大面积褐腐病的发生[3-4]。咪鲜胺、万香思瑞、抑霉唑、甲基托布津等合成杀菌剂虽可有效抑制采后柑橘或柠檬果实褐腐病的发生，但化学残留的风险极大地限制了此类药剂的使用，因此亟待开发绿色高效的柠檬采后保鲜新技术[5-6]。【前人研究进展】可食性涂膜是安全高效的果实采后保鲜处理方案，其可在果实表面形成薄膜，起到物理屏障作用，从而阻止病原菌侵染并调控果实生理[7]。研究表明，应用壳聚糖、海藻酸钠、植物胶等多糖类材料进行涂膜处理可有效降低柑橘类果实生理代谢水平、诱导果实抗性或直接抑制病原菌生长，从而显著减少采后果实病害发生率，延长果实贮藏周期[8]。【本研究切入点】菊科植物小蓟(Cirsiumsetosum)即小蓟草，别名刺儿菜，是典型的药食同源性植物，小蓟多糖是从中提取出的一种高分子有机多糖，无毒、无味且被膜性好，具有作为果实被膜剂的潜力[9]。但单一多糖类涂膜剂也存在成膜稳定性差、抑菌功效有限、作用周期短等弱点，故复合涂膜是改善多糖涂膜剂对采后果实保鲜效果的有效手段[10]。诺米林是柠檬苦素类化合物的最主要苷元之一，是柠檬主要的呈苦物质，具有较强的广谱抗菌能力[11]；但诺米林暴露于空气中易发生氧化反应，将其共混入涂膜剂中可提高并延长抑菌作用[12]。【拟解决的关键问题】本研究通过分析小蓟多糖—诺米林复合涂膜对“尤力克”柠檬果实的保鲜效果，通过响应面分析法确定最佳制备方案，为柠檬鲜果贮藏保鲜及病害防控提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验果实

供试果实为达商业成熟度的“尤力克”柠檬[Citruslimon(L.)Burm. F.]，分别于2017和2018年秋季采摘于重庆市潼南区柏梓镇汇达柠檬示范种植基地，随后1 h内运回实验室。挑选出无病虫斑、外形规则、表皮光洁呈浅黄绿色、果横径在5.5～8.0 cm的一级柠檬鲜果(GB/T 29370—2012)，经纯净水洗去浮尘后，用75%乙醇溶液对果实进行表面消毒后自然风晾干待用。

1.2 试验设计

1.2.1 复合涂膜剂制备方法 小蓟多糖参考聂倩等[13]方法，使用AB-8大孔树脂从小蓟中进行提取。小蓟多糖—诺米林复合涂膜剂根据实验室前期试验数据(单因素试验)进行制备[14]，具体步骤如下：将60～70 g小蓟多糖、0.2～0.4 g山梨酸钾、0.02～0.04 g D-异抗坏血酸钠和0.2～0.3 g甘油单硬脂酸酯溶解于1000 mL无菌水即制得小蓟多糖溶液，冷藏备用。同时，将1.8～2.0 g诺米林、1.6～2.0 g低甲氧基果胶、0.2～0.4 g硬脂酰乳酸钠和0.10～0.12 g二氧化硅溶解于1000 mL无菌水即制得诺米林乳浊液，冷藏备用。最后，取制备好的小蓟多糖溶液和诺米林乳浊液按(1∶1)～(3∶1)的体积配比混合至1800 mL，于45 ℃加热融化，调节pH至5.5，无菌水定容至2000 mL，即可得小蓟多糖—诺米林复合涂膜液。

1.2.2 涂膜处理 2017年10月试验主要探讨小蓟多糖—诺米林复合涂膜处理对柠檬果实冷藏期间腐烂率及品种的影响，以确定复合涂膜剂制备的最佳工艺参数。将预处理后的柠檬鲜果浸泡于制备好的不同配方配置的复合涂膜剂中10 min后取出，自然风晾干后分装于0.3 mm厚的PET包装盒(每个包装盒顶部预留直径1 mm的圆形通气孔6个)。每个包装盒分装4 颗果实，并于(4±1) ℃、相对湿度80%～90%的环境贮藏24 w。以没有涂膜的柠檬果实为对照组1(CK1)，300 mg/L咪鲜胺处理为对照组2(CK2)。贮藏结束后，取鲜样测定果实腐烂率及品质参数。各处理组40颗果实，重复3次，整个试验重复2次。

2018年10月试验着重分析最佳参数下小蓟多糖—诺米林复合涂膜处理对柠檬果实冷藏期间的保鲜效果。将柠檬鲜果浸泡于最佳参数下的复合涂膜剂中进行涂膜处理，处理方法、分装和贮藏条件同前期试验。处理完成后，柠檬果实同样于(4±1) ℃条件下贮藏24 w，其间每6 w取鲜样测定果实各项品质指标。以没有涂膜的柠檬果实为对照组，2组处理各120颗果实，重复3次，整个试验重复2次。

1.2.3 主要因素筛选 根据1.2.1中复合涂膜剂制备参数范围，应用Design Expert 8.0软件中的Box-Behnken程序，以小蓟多糖含量、山梨酸钾含量、D-异抗坏血酸钠含量、甘油单硬脂酸酯含量、诺米林含量、低甲氧基果胶含量、硬脂酰乳酸钠含量、二氧化硅含量、小蓟多糖溶液和诺米林乳浊液配比为自变量(表1)，以柠檬鲜果冷藏24 w后的腐烂率为考察值，分析各因素对小蓟多糖—诺米林复合涂膜处理效果的影响，以筛选出主要影响因素。

表1 三水平试验设计

1.2.4 响应面法优化 通过对主要影响因素的筛选，得出小蓟多糖、诺米林和复合涂膜剂配比为影响冷藏期间柠檬鲜果腐烂发生的主要因素。以此为基础，应用Design Expert 8.0软件中的旋转中心组合设计功能对复合涂膜剂的制备参数进行优化。以小蓟多糖(X1)、诺米林(X2)和复合涂膜剂配比(X3)为自变量，并以+1、0、-1分别表示自变量的3个水平，以腐烂率(Y1)、固酸比(Y3)、柠檬苦素含量(Y4)为响应值，按照表1中的组合条件配制涂膜液分别对柠檬果实进行涂膜处理，处理方法和分装同1.2.2。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 腐烂率 柠檬果实表面出现霉菌性病斑即记为烂果。腐烂率(%)=(烂果数/总果数)×100%。

1.3.2 固酸比 固酸比(TSS/TA)=可溶性固形物含量/可滴定酸含量。用手持折光仪测定可溶性固形物含量；采用标准氢氧化钠滴定法测定可滴定酸，结果以柠檬酸百分含量表示[15]。

1.3.3 柠檬苦素含量 取5 mL柠檬汁样品于三角烧瓶中，加入50 mL乙酸乙酯后超声30 min，随后于4 ℃ 5000 r/min离心10 min，取上清于50 ℃下旋转蒸发至近干，用乙腈溶解定容至5 mL，过0.22 μm滤膜后参照陈静等[16]的高效液相色谱法对样品中柠檬苦素含量进行定量。

1.3.4 果实品质指标的测定 果实呼吸强度和乙烯释放量分别采用气流法和气相色谱法进行测定[15]。总糖含量采用斐林试剂滴定法进行测定[13]，总酚含量测定参考Flion-Ciocalteu法[17]，总黄酮按WANG等[15]的方法进行测定；丙二醛含量与相对电导率分别采用硫代巴比妥酸法和电导仪法[18]进行测定；参考Almeida等[19]的方法，采用ABTS自由基清除能力对果实抗氧化能力进行分析，抗氧化能力用奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)当量表示。

1.4 数据处理

采用Design Expert 8.0软件进行试验数据分析和二次回归模型的构建获得复合涂膜剂制备的最佳参数。方差分析中显著水平为P<0.05，极显著水平为P<0.01。

2 结果与分析

2.1 主要因素筛选结果

以柠檬果实冷藏期间的腐烂率为响应值，对小蓟多糖含量、山梨酸钾含量、D-异抗坏血酸钠含量、甘油单硬脂酸酯含量、诺米林含量、低甲氧基果胶含量、硬脂酰乳酸钠含量、二氧化硅含量、复合涂膜剂配比进行三水平试验。方差分析结果显示，各因素按显著性排列为小蓟多糖含量(0.0210)>复合涂膜剂配比(0.0231)>诺米林含量(0.0266)>山梨酸钾(0.0955)>硬脂酰乳酸钠(0.2386)>甘油单硬脂酸酯(0.2765)>低甲氧基果胶(0.3370)>二氧化硅(0.3881)>D-异抗坏血酸钠(0.8621)；且小蓟多糖含量、诺米林含量、复合涂膜剂配比等因素置信度均高于95%。以此为基础，选取小蓟多糖含量、诺米林含量、复合涂膜剂配比这3个显著因素做进一步响应面分析，以确定这3个因素所对应的最优水平。同时，选取山梨酸钾0.27 g、D-异抗坏血酸钠0.03 g、甘油单硬脂酸酯0.22 g、低甲氧基果胶1.67 g、硬脂酰乳酸钠0.27 g、二氧化硅0.11 g以进行后续优化试验。

2.2 回归方程的建立

以柠檬果实冷藏后的品质指标如腐烂率、TSS/TA和柠檬苦素含量为响应值Yi，对试验数据进行拟合，得到一个二次多项式：Yi= a0± a1X1± a2X2± a3X3± a12X1X2± a13X1X3± a23X2X3± a11X12± a22X22± a33X32

(1)

式中，Yi为预测响应值，小蓟多糖含量(X1)、诺米林含量(X2)和复合涂膜剂配比(X3)，a0为截距(常数项)，a1、a2、a3为线性系数，a11、a22、a33为平方系数，a12、a13、a23为交互作用系数。4 ℃下贮藏24 w后，各复合涂膜处理组与对照组柠檬果实的腐烂率、TSS/TA和柠檬苦素含量的实测值见表2。

以此结果为基础，通过Design Expert 8.0软件对实验数据进行二次多项回归拟合，分别获得腐烂率、TSS/TA和柠檬苦素含量与复合涂膜剂中小蓟多糖含量、诺米林含量及复合涂膜剂配比四因素间的二次多项回归方程，利用其预测的果实腐烂率、TSS/TA和柠檬苦素含量数值见表2。

2.3 响应曲面的分析与优化

利用Design Expert 8.0软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到各因素间的两两交互作用对柠檬鲜果腐烂率、固酸比、柠檬苦素含量的响应曲面和等高线图(图1～2)。曲面图可确定各因素的最佳参数范围，等高线图则可用于评价各因素间交互效应的强弱[20]。

如图1-A所示，随着小蓟多糖和诺米林含量的增加，柠檬果实腐烂率呈先降后升的趋势，当小蓟多糖含量在64～66 g、诺米林含量为1.85～1.95 g时，柠檬果实冷藏24 w后的腐烂率较低；而当小蓟多糖含量低于62 g或高于68 g，诺米林含量低于1.85 g或高于1.95 g时，果实腐烂率急剧上升。由图1-C，1-E可知，腐烂率随复合涂膜剂中配比的增大快速降低，达到最低值后又迅速上升，当复合涂膜剂配比约为2∶1时，腐烂率达到最低值。同时，小蓟多糖和诺米林含量的等高线图近似椭圆形，说明两因素间的交互作用显著(P=0.0024<0.05，图1-B)。

柠檬苦素是柑橘属植物中具有生物活性的氧化性四环三萜类化合物，其含量的高低直接关系柠檬果实保健价值[21]。图2-A，2-C反映出涂膜剂中小蓟多糖含量对果实柠檬苦素含量影响的曲面图坡度较为陡峭，表明涂膜剂中小蓟多糖含量对果实柠檬苦素含量的影响显著(P=0.0489<0.05)。图2-E中响应曲面变化平缓，表明诺米林含量及复合涂膜剂配比两因素对果实柠檬苦素含量的影响不显著。

2.4 复合涂膜剂制备工艺优化和最优条件验证

通过对表2以及图1～2的结果可知，除柠檬果实固酸比对涂膜剂构成不敏感外，果实腐烂率和柠檬苦素含量均受涂膜剂中小蓟多糖含量、诺米林含量及复合涂膜剂配比影响，其中涂膜剂中诺米林含量是影响果实品质的首要因素，其次为小蓟多糖含量，最后则为复合涂膜剂配比。根据表2的试验结果，当设定柠檬果实经冷藏24 w后的腐烂率小于6.2、柠檬苦素含量分别高于250 μg/g、固酸比不低于1时，使用Design Expert对回归方程求解，优化出当复合涂膜剂中小蓟多糖含量为64.65 g，诺米林含量为1.90 g，复合涂膜剂配比为2.01时，有最佳处理效果：腐烂率为6.07%，固酸比为1.15，柠檬苦素含量为268.80 μg/g。

表2 旋转中心组合设计实验和预测结果

图1 试验交互因素影响柠檬果实腐烂率的曲面图和等高线图Fig.1 Surface and contour plots of experimental interaction factors affecting the decay incidence of lemon

图2 试验交互因素影响柠檬果实柠檬苦素含量的曲面图和等高线图Fig.2 Surface and contour plots of experimental interaction factors affecting the limonin content of lemon

为便于实际生产，将复合涂膜剂制备工艺调整为小蓟多糖含量64.5 g，诺米林含量1.90 g，复合涂膜剂配比2。使用此参数核对优化数据可靠性，结果显示，采用该工艺参数制备的复合涂膜剂对柠檬果实进行涂膜处理能显著(P<0.05)抑制柠檬果实冷藏期间腐烂的发生，同时该处理下果实固酸比及柠檬苦素含量均明显高于对照果实，且与咪鲜胺处理的果实无显著性差异(表3)。同时，模型预测值的相对误差均在±3%内，无统计学上的差异，说明该模型所得的优化参数可靠，且重现性好。

表3 验证试验结果

2.5 复合涂膜处理对柠檬果实贮藏品质及抗氧化活性的影响

由表4可见，冷藏期间柠檬果实呼吸强度和乙烯释放量小幅下降，抗氧化能力、总糖、总酚及总黄酮呈现先增后降的变化趋势，丙二醛含量及相对电导率逐渐上升。贮前复合涂膜剂处理可降低果实的呼吸强度和乙烯释放量，延缓果实MDA含量及相对电导率的上升，保持果实较高的总糖及抗氧化物质(总酚、总黄酮)含量，从而维持果实综合品质。

表4 复合涂膜处理对柠檬果实贮藏品质及抗氧化活性的影响

3 讨 论

近年来，纤维素及其衍生物羟丙基甲基纤维素(HPMC)、魔芋葡甘露聚糖(KGM)、壳聚糖(CTS)、淀粉、海藻酸钠、果胶等多种多糖类大分子材料均被证实可作为被膜剂用于果蔬采后涂膜保鲜处理[8]。此类多糖类涂膜处理安全性高，能形成微气调环境从而有效降低果实生理代谢水平，延长果实贮藏周期。但大多数多糖材料具有亲水性高、分散性强、易降解、无抑菌作用的缺点，因此在多糖类涂膜剂中加入改性材料或生物活性物质可增强被膜稳定性，提升综合保鲜作用[22]。例如，在壳聚糖中加入纳米纤维素可有效提升砂糖橘和蜜橘果实被膜物质的稳定性[23]；采用经碱液改性的淀粉对草莓进行涂膜处理，较单一淀粉涂膜显著降低了草莓贮藏期间腐烂率和失重率[24]；而在壳聚糖涂膜剂中添加植物精油则赋予涂膜剂强烈且稳定的抑菌活性，从而有效抑制灰霉菌对采后草莓果实的侵染[25]。在本研究中，甘油单硬脂酸酯作为一种常见的非离子型的表面活性剂，添加入小蓟多糖溶液中更有助于小蓟多糖的分散；山梨酸钾和D-异抗坏血酸钠则可抑制小蓟多糖的氧化和变性，提高被膜稳定性[26]。诺米林作为芸香科植物中重要的三萜类类苦素物质，对毛霉、根霉和黑曲霉等多种真菌具有较强的抑制效果[27]。本研究将诺米林共混于低甲氧基果胶和硬脂酰乳酸钠组成的乳浊液中，可起到分散和缓释的作用，最大程度提高诺米林抑菌功效。因此，将小蓟多糖分散溶液与诺米林乳浊液共混制得复合涂膜剂既维持了较高的稳定性，也提高了涂膜剂的抗菌活性。配方经过优化，得出当小蓟多糖含量64.65 g，诺米林含量1.90 g，小蓟多糖溶液与诺米林乳浊液体积配比2.01∶1时，小蓟多糖—诺米林复合涂膜处理能显著降低柠檬鲜果冷藏期间腐烂病的发生，并维持果实较高Vc和柠檬苦素含量。此外，经小蓟多糖—诺米林复合涂膜处理的柠檬果实在冷藏24 w后的腐烂率与咪鲜胺处理组果实相比无显著差异，说明在柠檬采后保鲜中，该复合涂膜具有替代合成杀菌剂的潜力。

采后贮藏过程中，果实细胞膜脂过氧化程度逐渐提高，膜脂氧化产物丙二醛含量和细胞膜透性逐渐上升，最终导致果实发生生理衰老和品质劣变[28]。小蓟多糖—诺米林复合涂膜处理显著降低了柠檬果实在冷藏期间呼吸强度和乙烯释放量，同时果实丙二醛含量和相对电导率显著低于而果实的品质参数(如总糖、抗氧化物质含量及抗氧化能力)，显著高于对照果实，这表明复合涂膜处理可显著延缓柠檬果实采后生理代谢水平，延缓衰老进程，从而维持果实较高品质和功能性。

4 结 论

本试验采用三水平试验及响应曲面优化法，以柠檬果实冷藏期间腐烂率和品质参数为响应值，确定了小蓟多糖—诺米林复合涂膜液的最佳制备工艺参数为：小蓟多糖64.65 g，诺米林1.90 g，复合涂膜剂配比2.01∶1。在此参数下，果实冷藏24 w后仍可维持较高的食用品质。

小蓟多糖—诺米林复合涂膜可显著降低柠檬果实冷藏期间腐烂率，延缓果实衰老进程和品质劣变速度，进而可有效提升果实商品性并延长果实贮运期。