他克林对脂多糖诱导小鼠睾丸支持细胞炎性损伤的保护作用

蔡金霞，黄明光，胡传活，张 鑫，梁莹莹，纪伟霞，冯 妮，葛晨玲，陈志英，李 珣，王晓晔

(1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530004；2.广西畜牧研究所，南宁 530001)

【研究意义】养殖场中动物炎症时有发生，而炎症的存在对生殖会产生一定影响，如公畜的睾丸炎会抑制精子发生和成熟，降低其质量和繁殖能力[1]；母畜的乳房炎导致泌乳能力下降，致使幼仔断奶后成活率降低[2]，严重时甚至危及母畜生命，影响其利用价值和使用年限[3-4]。睾丸炎多由细菌感染引起，而脂多糖( Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，可引起动物机体组织和细胞分泌炎性因子，动物体内极少量的LPS即可引起广泛的炎症反应[5-6]。睾丸支持细胞(Sertoli cells，SCs)是众多环境污染物作用于雄性生殖系统最重要的靶细胞，也是动物体内和体外试验中评价雄性生殖系统毒性损伤的良好模型[7]。由于SCs在精子发生过程中发挥着重要作用，因此任何影响或引起其功能异常的因素均可使精子发生异常，进而导致不育[8]。他克林是用于治疗阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)的第1种药物，具有很高的脂溶性，容易透过血脑屏障，具有抑制组织中乙酰胆碱酯酶活性、增加乙酰胆碱含量、作为受体激动剂促进乙酰胆碱释放、促进脑组织对葡萄糖利用而提高记忆力和学习能力及下调Kv2.1通道表达促进细胞增殖等药理作用[9]。广西大学动物科学技术学院动物解剖实验室研究发现，他克林在猪精子液态保存和冷冻保存方面具有很好的抗凋亡效果[10-11]。但是，目前关于他克林对雄性动物生殖细胞炎性损伤作用的研究鲜见报道。因此，分析他克林对LPS诱导小鼠睾丸支持细胞(Mouse testis sertoli cells，TM4)炎性损伤的保护作用，可为雄性动物生殖疾病相关抗炎药物的利用及精子质量提高提供更多药物选择。【前人研究进展】Hu等[10]研究发现，0.05、0.10和0.15 mmol/L他克林均可显著或极显著提高猪精子的冻后质量，其中0.10 mmol/L的处理效果最佳。黄明光等[11]研究表明，他克林对猪精液的常温和低温保存具有积极作用，以0.10 mmol/L的处理效果最佳，说明稀释液中他克林浓度为0.10 mmol/L时能延长猪精子的寿命从而显著改善其保存效果。SCs具有为生精细胞提供营养、激素转化、屏障隔离和吞噬等功能，外源性化合物对其影响较明显[12]。已有研究对女贞子多糖在TM4炎性损伤中能量代谢的保护作用进行探讨[13]，但炎症是一个复杂的病理过程，女贞子多糖是否对TM4代谢功能具有直接调节作用，或者是通过对其他功能(如免疫功能)的调节间接影响代谢功能，还有待进一步探究。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)信号通路是维持组织稳态和防止炎症病理的关键，与细胞存活和凋亡相关[14]，TNF是激活核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的主要细胞因子，同时也能诱导细胞凋亡和坏死[15-16]。Pan等[17]研究表明，SCs的免疫豁免特性为细胞、组织和器官的替代治疗提供了新思路，当SCs受到LPS刺激后NF-κB信号通路被激活，相应的闭合蛋白表达下调，SCs细胞表面闭合蛋白内化，血睾屏障完整性遭到破坏；腮腺炎病毒感染小鼠睾丸后会诱导TM4中TNF-α、白细胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)蛋白表达上调，在LPS诱导下，TM4分泌促炎因子TNF-α。Wu等[18]研究发现，在应用NF-κB抑制剂后，TNF-α和IL-6蛋白分泌减少，暗示NF-κB信号通路对这些细胞因子和趋化因子的产生发挥重要作用。【本研究切入点】目前，有关他克林对TM4保护作用相关信号分子(NF-κB、TNF-α和IL-6等基因mRNA和蛋白)表达变化情况的研究未见报道。【拟解决的关键问题】以TM4为研究对象，从炎症角度进一步探索他克林对雄性动物生殖相关细胞的抗炎保护作用，为雄性动物生殖疾病相关药物的利用及精子质量的提高提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

TM4购自武汉普诺赛生物科技有限公司；他克林购自上海相辉医药有限公司；LPS购自美国Sigma公司；DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清和马血清购自上海源叶生物科技有限公司；CCK8试剂购自日本同仁化学研究所；IL-6和TNF-α酶联免疫吸附测定法检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，引物购自华大基因科技有限公司，NF-κB抗体购自美国Abcam公司。

主要仪器设备：CO2细胞培养温箱(赛默飞世尔科技有限公司)、倒置显微镜(CKX31，奥林巴斯科技有限公司)、细胞计数板(上海市求精生化有限公司)、96孔板和6 cm2细胞培养皿(广州洁特生物过滤制品技术有限公司)、电子分析天平(生物卓精电子科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 将TM4置于含有抗生素(100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)、5%马血清(HS)和2.5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12细胞培养基中，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养[19]。

1.2.2 LPS对TM4增殖的影响 取生长状态良好的对数期TM4，以密度为5×103个/mL接种于96孔细胞培养板，置于细胞培养箱培养24 h。小心弃去上清，再加入含不同浓度LPS[0.00(空白组)、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL]的DMEM/F12溶液，分别处理3.0、6.0、12.0和24.0 h后，每孔加入CCK8溶液，用酶标仪于450 nm处测定OD值，并计算细胞增殖率，细胞增殖率大于90.00%表明此浓度的LPS对细胞增殖无明显抑制作用[3]。将筛选出LPS对TM4损伤的最佳浓度和时间用于后续试验。

1.2.3 CCK8法检测他克林对LPS诱导TM4损伤的保护作用 96孔细胞铺板方法同1.2.2，后续操作如下：在上述1.2.2筛选出的LPS损伤浓度和时间基础上，加入含不同浓度他克林的DMEM/F12溶液进行保护。共9组细胞样品，组1为未加任何药物的空白组，组2～9分别为先用1.00 μg/mL LPS诱导损伤12.0 h，再用他克林相应浓度(100 000.00、10 000.00、1000.00、100.00、10.00、1.00、0.10和0.01 μg/mL)对细胞进行后处理，每组6个重复孔。放入细胞培养箱继续分别加入LPS进行前保护处理0.5、1.0、2.0 h和加入LPS进行后保护处理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h后，每孔加入10.0 μL CCK8溶液。CCK8检测方法同1.2.2。筛选出他克林对LPS诱导TM4损伤保护作用的最佳浓度和时间用于后续试验。

1.2.4 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IL-6和TNF-αmRNA基因表达情况 试验分为空白组、LPS组和药物组共3组，其中，空白组加入DMEM/F12溶液3.0 mL，LPS组加入含LPS的DMEM/F12溶液3.0 mL，药物组使用1.2.2筛选出的LPS损伤浓度和时间处理后，再加入经1.2.3筛选出的他克林最佳保护浓度和时间处理的DMEM/F12溶液3.0 mL继续培养6.0 h。细胞总RNA提取、反转录按照荧光定量试剂盒说明进行操作，以GAPDH为内参基因，分析目的基因的mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 TM4炎症因子表达水平的荧光定量引物序列

1.2.5 ELISA法检测TM4培养上清中的TNF-α和IL-6蛋白释放量 按照1.2.4的细胞分组和处理方法提取细胞培养上清中的蛋白样品，按ELISA试剂盒操作说明进行ELISA检测。

1.2.6 Western Blot检测NF-κB蛋白表达 共分析7组细胞样品，组1为未加入任何药物的空白组，组2为LPS组(1.2.2筛选出的LPS损伤浓度和时间组)，组3为他克林组(1.2.3筛选出的他克林保护浓度和时间组)，组4～7分别为先采用1.2.2筛选出的LPS损伤浓度和时间，再用他克林(0.01、1.00、100.00和10 000.00 μg/mL)后处理6.0 h组。以1.2.4中提取的蛋白为目的蛋白，将配制好的一抗(以抗体∶PBST溶液1∶18 000稀释)进行免疫印迹，以β-actin为内参蛋白，分析目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 24.0进行统计，以单因素方差分析进行组间差异性显著性比较。

2 结果与分析

2.1 LPS对TM4增殖的影响结果

如表2所示，空白组的TM4增殖情况良好；随着LPS浓度的升高，100.00 μg/mL LPS诱导处理3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分别为70.00%、66.00%、70.00%和81.00%，均极显著低于空白组(P<0.01，下同)；随着LPS处理时间的延长，各浓度LPS诱导处理12.0和24.0 h的TM4增殖率均显著或极低于空白组(P<0.05，下同)；各LPS浓度及相应诱导时间分别处理的TM4增殖率存在差异，如0.01 μg/mL LPS诱导处理6.0 h的TM4增殖率为110.00%，极显著高于空白组；而0.10、1.00 μg/mL LPS诱导处理6.0 h的TM4增殖率分别为87.00%和89.00%，极显著低于空白组；而在所有LPS浓度诱导处理中，1.00 μg/mL LPS诱导处理12.0 h的TM4增殖率最低，为38.00%，极显著低于空白组。说明随着LPS浓度的升高和诱导时间的延长，LPS诱导损伤的趋势逐渐增加，而在不同浓度不同处理时间下，LPS对TM4增殖的影响又存在一定的差异，其中1.00 μg/mL LPS诱导TM4 12.0 h更容易产生炎性损伤。

表2 不同浓度LPS对TM4增殖率的影响

2.2 他克林对LPS诱导TM4损伤的保护作用

如表3所示，10 000.00 μg/mL他克林预处理2.0 h的TM4增殖率为87.00%，显著低于空白组，10 000.00、100 000.00 μg/mL他克林预处理0.5和1.0 h或后处理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分别为73.00%、68.00%、66.00%、80.00%、81.00%、30.00%、63.00%、75.00%和7.00%、13.00%、29.00%、36.00%、5.00%、15.00%、75.00%、40.00%，均极显著低于空白组。

表3 不同处理时间、不同浓度他克林对LPS诱导TM4损伤的保护作用(TM4增殖率)

而随着他克林浓度的降低及时间的延长，如他克林浓度0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL后处理 24.0 h的TM4增殖率分别为117.00%、116.00%、116.00%、114.00%和他克林浓度0.01 μg/mL后处理 6.0 h的TM4增殖率为122.00%，均显著高于空白组。说明他克林不同浓度、不同处理时间对TM4增殖的影响存在差异，随着他克林浓度的降低及处理时间的延长，其对TM4的保护作用趋于加强，其中0.01 μg/mL他克林后处理 6.0 h对TM4的保护效果最佳。

2.3 他克林对LPS诱导下TM4 IL-6 和TNF-α基因mRNA表达的影响

如图1所示，空白组TM4的IL-6(图1-A)和TNF-α(图1-B)基因mRNA相对表达量均较低；与空白组比较，LPS组TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相对表达量分别显著和极显著上调；与LPS组比较，药物组TM4的IL-6基因mRNA相对表达量显著下调，TNF-α基因mRNA相对表达量极显著下调。说明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相对表达量，从而降低炎症反应。

#和##分别表示与LPS组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)；*和**分别表示与空白组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下同Compared with the LPS group，# represented significant difference(P<0.05),and ## represented extremely significant difference(P<0.01).Compared with the blank group,* represented significant difference(P<0.05),and ** represented extremely significant difference(P<0.01).The same as below图1 他克林对LPS诱导TM4 TNF-α和IL-6基因mRNA表达的影响Fig.1 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.4 他克林对LPS诱导TM4培养上清中TNF-α和IL-6蛋白释放量的影响

如图2所示，空白组TM4培养上清的IL-6(图2-A)和TNF-α(图2-B)蛋白表达量均较低；与空白组比较，LPS组TM4的培养上清的IL-6和TNF-α蛋白表达量均显著上调；与LPS组比较，药物组TM4培养上清的IL-6和TNF-α蛋白表达量均显著下调。说明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α蛋白表达量，从而降低炎症反应。

图2 他克林对LPS诱导TM4培养上清TNF-α和IL-6蛋白表达的影响Fig.2 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.5 他克林对LPS诱导TM4 NF-κB蛋白表达的影响

为探究他克林对LPS诱导TM4 NF-κB蛋白表达的影响，采用WB法检测经不同浓度他克林处理不同时间后TM4的NF-κB蛋白表达情况。从图3-B可看出，与空白组(组1)相比，LPS组(组2)TM4的NF-κB蛋白表达量显著上调；与LPS组相比，他克林浓度为1.00(组5)、100.00(组6)和10 000.00 (组7)μg/mL后处理6.0 h可极显著上调NF-κB蛋白表达量，而0.01 μg/mL他克林后处理6.0 h(组4)可降低NF-κB蛋白表达量，但差异不显著(P>0.05)。说明0.01 μg/mL他克林对LPS诱导TM4损伤后处理6.0 h对降低NF-κB蛋白表达量效果不明显,适当降低他克林浓度或增加保护时间可能效果更佳。

图3 他克林对LPS诱导TM4 NF-κB蛋白表达的影响Fig.3 Effect of tacrine on NF-κB expression in LPS-induced TM4 cells

3 讨 论

他克林是一种西药，临床使用始于1993年，是由美国FDA批准上市用于AD治疗的第一代药物之一，具有细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结2种病理特征[21]。目前对AD的确切发病机制尚不清楚，一般认为炎症、代谢应激和钙超载等多种因素参与该病的暴发[22-23]。关于他克林的研究目前已证实其在AD治疗方面效果理想，但长时间高剂量服用存在肝脏毒性，而对其他疾病的治疗效果有待进一步验证[24]。已有研究表明，他克林暴露在表达乙酰胆碱酯酶的细胞(例如神经元)中可导致错误折叠的乙酰胆碱酯酶在内质网积聚，这种错误折叠的酶不能转运到高尔基体/质膜，从而导致内质网胁迫及其下游的未折叠蛋白信号级联反应[24]。Liu等[24]研究发现，一旦内质网应激过大，内质网与线粒体的协同作用会增加线粒体膜电位损失，导致暴露于他克林的细胞失去稳态，发生凋亡。郑鑫[25]也研究发现，他克林通过诱导细胞内活性氧的过量生成和谷胱甘肽耗竭，诱导HepG2细胞DNA氧化性损伤和断裂，还诱导HepG2细胞的微核形成增加，说明他克林具有遗传毒性。已知的他克林不良反应还包括肝毒性[25]和消化道反应，且仅对轻度和中度AD症状治疗有效，对重度症状无效[21]。尽管如此，越来越多的证据表明，他克林对凋亡和氧化损伤也有一定的保护作用，且可促进细胞增殖[26-29]。此外，他克林对细胞具有一定的增殖作用，其作用机制可能为K+外流减少引起的去极化可增加胞内Ca2+浓度，加速细胞增殖[30]，因此，他克林可能对Ca2+增加后的细胞凋亡和氧化应激具有保护作用[9]。本研究结果与上述研究结果相似，0.01 μg/mL他克林可减少LPS对TM4造成的炎性损伤，而10 000.00和100 000.00 μg/mL他克林呈现一定的细胞毒性，充分说明他克林的细胞毒性和保护性与其浓度相关；与LPS组相比，药物组的NF-κB蛋白表达量略低，但差异不显著，再稀释10或5倍梯度或者增加保护时间对TM4炎性损伤的保护作用可能更好。

他克林的化学结构是平面、亲水性结构，很容易通过血脑屏障，且血脑屏障、血睾屏障和其他血液组织屏障均具有限制水、电解质、离子、激素、旁分泌因子和其他外源生物分子的细胞旁(细胞间)和跨细胞扩散的共同特征，产生这些屏障的结构蛋白相似，在功能上也有相似之处[31]。如生物活性肽(F5肽、NC1肽、Lg3肽、Lg4肽和Lg5肽)可能在血脑屏障和其他血液—组织屏障中发挥作用，这些生物活性肽及其下游信号蛋白也可能影响其他血液—组织屏障的细胞旁和跨细胞药物扩散[31]。基于上述研究结果，本研究中他克林对TM4炎性损伤的保护作用机制可能是：①抑制TM4中乙酰胆碱酯酶活性，增加乙酰胆碱含量；②作为TM4中某种受体激动剂，促进乙酰胆碱释放；③促进TM4对葡萄糖的利用，促进细胞增殖；④减轻TM4凋亡，从而改善炎性损伤。他克林改善TM4炎性损伤的具体机制是否与其对神经细胞的作用机制相似，或是否通过穿过血睾屏障产生相应的作用有待进一步探究。

曾有研究发现，LPS抑制细胞活力呈现浓度依赖性[32]且炎症可使IL-6蛋白含量显著升高[33]，但本研究发现，LPS抑制细胞活力不仅与抑制浓度和时间关系密切，且其诱导的TM4中TNF-α和IL-6基因mRNA和蛋白表达量显著升高，推测他克林能通过调节TM4分泌TNF-α和IL-6等炎症蛋白从而影响炎症反应。目前对于他克林的探索大多基于他克林的平面、亲水性结构进行多功能药物设计，采用多靶点定向配体方法有望开发出有效的新药[34]。基于药物开发史上“老药新用”(由于发现新的作用机制，而不是增加适应症)的成功范例，他克林的多重作用及其可能的生理意义值得进一步探讨，从而为雄性动物生殖系统疾病的治疗乃至精子的生产和保存等提供更多的药物选择。

4 结 论

LPS对TM4增殖产生一定的影响，其中1.00 μg/mL LPS诱导处理12.0 h易于产生TM4炎性损伤；他克林对TM4炎性损伤具有一定的保护作用，其中0.01 μg/mL后处理6.0 h的保护作用最佳，其保护作用可能与IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表达量下调有关。