铜锌交互效应对方格星虫稚虫生长和生理机能的影响

许明珠，董兰芳，李恒慧，李世才，陈瑞芳，张 琴，彭慧婧，龙子扬，林立蔚

(1.广西海洋研究所有限责任公司/广西海水养殖新品种繁育工程技术研究中心，广西 北海 536000；2.合浦县水产技术推广站，广西 合浦 536100；3.广西科学院，南宁 530007；4.广西民族大学海洋与生物技术学院/广西多糖材料与改性实验室/广西高校微生物与植物资源利用重点实验室，南宁 530006)

【研究意义】方格星虫(Sipunculusnudus)又称光裸方格星虫、光裸星虫、沙虫，是一种具体腔、不分节的海洋蠕虫，隶属于方格星虫科方格星虫属，在我国主要分布于热带和亚热带海域，尤其以广西沿海资源最丰富[1]。方格星虫营养丰富，蛋白含量达79.90%，且含有20种脂肪酸和多种微量元素，兼具药理作用，深受消费者追捧，是广西沿海一种重要的海洋经济生物[2-5]。自2008年广西海洋研究所有限责任公司突破规模化人工苗种技术以来，在广西和广东沿海地区掀起了方格星虫养殖热潮。目前市场上尚未研发出一款经济高效的方格星虫配方饲料，方格星虫仍以滩涂粗放养殖模式养殖为主，产量难以满足市场需求，其产品价格日益增高。广西海洋研究所方格星虫研究团队长期致力于方格星虫饲料营养研究，已完成三大营养元素、糖源及单一微量元素最适含量探讨。营养元素间存在复杂的相互促进和抑制作用，铜和锌是方格星虫生长发育的必需微量元素，受环境因素胁迫较多，但对其相互作用了解甚少。因此，开展微量元素铜锌交互效应对方格星虫稚虫生长和生理机能影响研究，对研发人工配合饲料以促进方格星虫养殖产业的可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】铜是血液中血蓝蛋白的重要组分，也是机体中细胞色素C氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)的组分，参与营养代谢和免疫等系列重要机体功能[6]。与无机矿物质相比，养殖动物对有机螯合矿物质的吸收率更高，常作为有效铜源添加至饲料中[7]。已有研究表明，饲料中适宜含量的铜能提高日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)幼虾的生长性能和免疫力，其血蓝蛋白的表达显著受饲料铜添加量影响，同时饲料铜和锌添加量均可影响日本沼虾生长、抗氧化和免疫性能，并在抗氧化和免疫性能方面存在交互效应[8]；饲料中添加10.0 mg/kg铜元素可显著提高斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的增重率，并降低饲料系数，且具有最高的血C铜和锌—SOD活性[9]。同样，锌广泛分布于机体内中，素有有“生命元素”之美称，是机体内多种金属酶的组成成分或激活剂，参与机体生长代谢、抗氧化和免疫等生理过程[10]。饲料中添加锌对方斑东风螺(Babyloniaareolate)[9]的生长具有明显影响，其软体部分锌含量随着饲料锌添加量的增加而显著增加，并显著影响其内脏团中多种酶的活力。仲晓丽[11]研究表明，饲料铜和锌交互仅对皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)的软体部蛋白含量、肝胰脏AKP酶活性和铁元素含量具有显著影响，并表现出一定的协同作用。李俊伟等[12]通过开展方格星虫矿物质元素组成及其生物富集特征研究，发现方格星虫对不同元素的生物富集能力不同，体壁铜元素和锌元素含量分别为2.8和8.4 mg/kg；本研究团队前期开展方格星虫稚虫饲料铜元素和锌元素单因素试验证实，方格星虫稚虫饲料适宜的铜添加水平为7.5～11.2 mg/kg[13]，适宜的锌添加水平为43.7 mg/kg[14]。铜和锌是同一副族元素，在化学性质上具有较多相似之处，且二者杂化轨道的化合价相似，致使这2种元素在吸收和金属酶合成时互相竞争蛋白的亲和部位，导致彼此间产生拮抗作用[15-17]。【本研究切入点】目前，针对方格星虫饲料铜锌交互影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以蛋氨酸铜为铜源、蛋氨酸锌为锌源，设计3×3双因素正交试验，探讨铜、锌交互效应对方格星虫稚虫生长和生理机能的影响，确定饲料中的铜和锌适宜添加量，以期为开发高效环保的方格星虫人工配合饲料提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试方格星虫稚虫采自广西北海市广西海洋研究所有限责任公司海水增养殖基地，为同批人工孵化苗种，平均体重(14.43±0.21)mg/条，自然状态下体长为1.21～1.67 cm。制作饲料前，分别对各原料进行蛋白、脂肪和能值测定，作为制定和调整饲料配方的依据。试验用基础饲料主要由酪蛋白、明胶、鱼油、糊精、卵磷脂、褐藻酸钠、微晶纤维素、维生素预混料和矿物质预混料组成，并用蛋氨酸铜和蛋氨酸锌调节试验饲料中的铜和锌元素含量(表1)。根据方格星虫铜、锌单因素试验结果，以适宜铜添加水平为7.5～11.2 mg/kg，适宜锌添加水平为43.7 mg/kg为基准，低于适宜添加量为低含量饲料，高于适宜添加量为高含量(过量)饲料。分别向基础饲料1～3号、4～6号和7～9号添加29.4、58.8和117.6 mg/kg蛋氨酸铜，换算成铜添加量分别为5.0(Cu1)、10.0(Cu2)和20.0(Cu3)mg/kg。添加蛋氨酸铜后，1、4和7号饲料添加蛋氨酸锌21.1 mg/kg，2、5和8号饲料添加蛋氨酸锌42.1 mg/kg，3、6和9号饲料添加蛋氨酸锌84.2 mg/kg，换算成锌添加量分别为20.0(Zn1)、40.0(Zn2)和80.0(Zn3)mg/kg(表2)。饲料制作过程：先将主要原料粉碎过100目筛，按照添加量从少至多逐级称重并混合均匀，与鱼油搓匀后再加少量水搓匀，烘干粉碎制成过100目筛的微颗粒饲料，装袋标号备用。

表1 试验饲料基础配方及营养成分(干物质)

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 养殖时间为2018年8—10月，养殖周期为8周。选用相同规格(65 cm×55 cm×45 cm)的27个水槽，在水槽底部均匀铺设1层(厚3～4 cm)细砂，用淡水彻底清洗消毒并经海水浸泡1 d，加入海水约40 cm，此为方格星虫稚虫的栖息地。选用健康无病、同一批次繁育的方格星虫稚虫8100条，以300条为1个重复，3个重复1组，随机分成9组，分别饲喂9种水平铜和锌元素混合的人工微颗粒饲料(处理1～9)。投喂方法为过量投喂，即保证沙子表面有少量未食用完全的饵料。饲养采用自然光照周期，24 h连续微充氧，水温维持在26～30 ℃，盐度维持在18‰～22‰，溶解氧大于5.0 mg/L。

表2 各处理饲料的铜和锌添加量

1.2.2 测定项目及方法 饲养结束后，将方格星虫稚虫转移至盛有海水(水深约10 cm)的无沙水槽中停食排沙24 h后称量各组总重，同时记录稚虫存活数量，计算各处理组方格星虫稚虫存活率。

存活率(Survival rate，%)=Nt/N0×100；

增重率(Weight gain rate，%)=(Mt-M0)/M0×100；

特定生长率(Specific gain rate，%)=(lnMt-lnM0)/t×100

式中，Nt为终末稚虫条数，N0为初始稚虫条数，Mt为终末平均体质量，M0为初始平均体质量，t为试验天数。

稚虫体成分和饲料常规成分采用AOAC[18]的方法进行测定，稚虫虫体匀浆液碱性磷酸酶(AKP)活性(U/mg)参考南京建成生物工程研究所试剂盒说明进行测定，虫体锌和铜元素含量采用GB/T 13885—2003《动物饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法》的方法进行测定。

铜锌交互效应采用折线图表示，折线相交即为饲料铜和锌添加量对其具有显著交互效应，折线不相交即为饲料铜和锌添加量对其无交互效应。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计和方差分析，以Tukey’s进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 铜锌交互效应下方格星虫稚虫的生长性能

由表3可知，经过8周的饲养，不同水平铜和锌处理组方格星虫稚虫的终末体重、增重率和特定生长率均显著提高(P<0.05，下同)。在9个处理中，以处理8(铜添加量为20.0 mg/kg，锌添加量为40.0 mg/kg)的方格星虫稚虫增重率和特定生长率最高；锌添加量为40.0 mg/kg处理组(处理2、处理5和处理8)的方格星虫稚虫增重率和特定生长率显著高于锌添加量为80.0 mg/kg处理验组(处理3、处理6和处理9)；当饲料铜添加量一定时，随着饲料中锌元素的增加，方格星虫稚虫的增重率和特定生长率呈先升后降的变化趋势；当饲料锌添加量一定时，改变铜添加量其方格星虫稚虫的增重率间和特定生长率间无显著差异(P>0.05，下同)。说明饲料中添加适量锌元素、过量铜元素不会显著影响方格星虫稚虫的生长性能(处理8)，但添加适量铜元素、过量锌元素会有效抑制方格星虫稚虫的生长发育(处理6)，同时过量的铜元素可在一定程度上改善过量锌元素对方格星虫稚虫生长性能的影响(处理9)。因此，推断方格星虫稚虫的增重率和特定生长率主要与饲料中锌元素含量相关。

从表3和图1～图3可看出，饲料中添加铜和锌对方格星虫稚虫增重率、特定生长率和存活率的交互效应显著；饲料中的铜元素含量适量或偏低(5.0和10.0 mg/kg)时，随着锌元素添加量的升高，各处理组方格星虫稚虫的存活率呈先升后降的变化趋势，说明方格星虫稚虫的存活率主要受饲料中锌添加量的影响；当饲料中的铜添加量上升至20.0 mg/kg(高含量)时，方格星虫稚虫的存活率主要受饲料中铜添加量的影响，但处理组的稚虫存活率差异不显著。

表3 铜锌交互效应对方格星虫稚虫生长性能的影响

图1 铜和锌添加量对方格星虫稚虫增重率的交互影响Fig.1 The interactive effect between copper and zinc on weight gain rate of juvenile peanut worm

图2 铜和锌添加量对方格星虫稚虫特定生长率的交互影响Fig.2 The interactive effect between copper and zinc on specific gain rate of juvenile peanut worm

图3 铜和锌添加量对方格星虫稚虫存活率的交互影响Fig.3 The interactive effect between copper and zinc on survival rate of juvenile peanut worm

2.2 铜锌交互效应下方格星虫稚虫的体成分

从表4可看出，各处理组方格星虫稚虫的水分含量在81.64%～82.78%，粗蛋白含量在58.46%～65.72%，粗脂肪含量在1.45%～1.72%，灰分含量在20.92%～24.92%。方差分析结果表明，饲料中不同铜添加量和锌添加量对方格星虫稚虫的上述指标均无显著影响。

表4 铜锌交互效应下的方格星虫稚虫体成分比较

2.3 铜锌交互效应下方格星虫稚虫的虫体铜和锌含量

由表5可知，各处理组方格星虫稚虫虫体的铜和锌含量均随着饲料中铜和锌添加量的变化而变化。其中，饲料铜添加量为10.0和20.0 mg/kg(处理4～9)时，稚虫虫体铜含量显著高于饲料铜添加量为5.0 mg/kg处理(处理1～3)；稚虫虫体锌含量随着饲料中锌添加量的增加而显著升高；高铜(20.0 mg/kg)高锌(80.0 mg/kg)饲料处理(处理9)稚虫的虫体铜元素和锌元素累积量最高。从图4～5可看出，饲料中的铜和锌添加量对方格星虫虫体铜和锌含量的交互效应不显著。

表5 铜锌交互效应下的方格星虫稚虫虫体铜和锌含量比较

2.4 铜锌交互效应下方格星虫稚虫虫体的AKP活性

由表6可知，各处理组方格星虫稚虫虫体的AKP活性均随饲料中锌添加量的增加呈先增后趋于平稳的变化趋势。其中，高锌(80.0 mg/kg)处理稚虫的AKP活性显著高于低锌(5.0 mg/kg)处理，即处理1、处理4和处理7稚虫的AKP活性较低，均显著低于其余处理。因此推断，方格星虫稚虫的AKP活性主要受饲料中锌添加量影响，但铜和锌2种元素对其无交互效应(图6)。

3 讨 论

微量元素是动物维持生命及其生产不可或缺的营养元素，体内微量元素的相互关系十分复杂，开展相关研究时所采用的微量元素剂量不同，微量元素间的相互关系也会发生变化[19]。影响微量元素利用率的因素主要有动物机体生理状态、微量元素化学形式及饲料中的抗营养因子[20]。选用利用率高的微量元素螯合物，合理控制饲料中微量元素含量，摸清微量元素间的协同或拮抗作用已成为当今饲料研究的热点[21]。许明珠等[13-14]研究表明，综合增重率和饲料成本考虑，方格星虫稚虫最适铜需要量

图4 铜锌交互效应下的方格星虫稚虫虫体铜含量Fig.4 Copper content of juvenile peanut worm under the interaction of copper and zinc

图5 铜锌交互效应下的方格星虫稚虫虫体锌含量Fig.5 Zinc content of juvenile peanut worm under the interaction of copper and zinc

表6 铜锌交互效应下方格星虫稚虫虫体的AKP活性比较

为7.5～11.2 mg/kg，最适锌需要量为41.93 mg/kg。本研究结果表明，氨基酸螯合微量元素铜和锌对方格星虫稚虫生长具有显著影响，且饲料中锌添加量的影响大于铜添加量，与前人对皱纹盘鲍[16]、黄颡鱼(PelteobagrusachelliRichardsor)[17]、花鱼骨(HernibarbusmacalatesBleekev)[22]、异育银鲫(CarassiusauratusGibelio)[23]、鲤(Cyprinuscarpio)[24]的研究结果一致。本研究中，当饲料中的铜添加量一定时，增加锌添加量的方格星虫稚虫增重率和特定生长率呈先升后降的变化趋势；当饲料中的锌添加量一定时，铜添加量发生变化但方格星虫稚虫的增重率和特定生长率无显著差异；饲料中锌元素过量会显著降低方格星虫稚虫的生长性能，铜元素过量对方格星虫稚虫生长性能无显著影响，但可在一定程度上改善过量锌元素对方格星虫稚虫生长性能的影响。究其原因可能是铜和锌元素二者互为竞争关系，过量的铜元素竞争了一部分锌元素的蛋白质亲和部位，从而降低过量锌元素对方格星虫生长的影响[12]。已有研究表明，饲料中添加过量锌元素会抑制黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)幼鱼和鲤的生长，饲料中添加适宜的锌元素对二者的增重具有正向效应[24-25]。锌元素过量导致的方格星虫稚虫生长性能降低，其原因可能在于方格星虫没有鳃器官，无法通过鳃排出多余的锌，导致体内锌累积过多，同时锌过量会影响方格星虫对其他元素的正常吸收，从而导致生长性能较低[26-27]。

图6 铜锌交互效应下方格星虫稚虫虫体的AKP活性比较Fig.6 The interaction between copper and zinc on AKP activity of juvenile peanut worm

本研究结果显示，饲料中的铜和锌添加量对星稚虫体成分无显著影响，与其他学者对方格星虫稚虫[12]、罗非鱼(Oreochromisniloticus)[21]、日本沼虾[28]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[29]进行单因素铜元素营养试验，以及对星斑川鲽(Platichthysstellatus)[30]、半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGunther)[31]进行单因素锌元素营养试验获得的结果相同，究其原因可能在于饲料中微量元素的增加能有效促进方格星虫快速生长，并合理利用饲料中营养物质合成自身物质。方格星虫主要摄食滩涂沉积物表层的有机物质和饵料，摄食过程必须利用适合口径的沙粒作为载体，因此方格星虫对不同元素的生物富集与其摄食的饵料密切相关。李俊伟等[ 12]研究发现，方格星虫体内的铜和锌元素与沉积物环境间呈一定的正相关。本研究中，饲料的铜和锌添加量对方格星虫稚虫虫体铜和锌含量均具有显著影响，虫体铜和锌含量均随饲料中铜和锌添加量的增加而显著增加，饲料中铜添加量不影响锌元素在方格星虫虫体内积累，但高铜高锌处理稚虫的虫体铜和锌元素累积量最高，与其他学者对皱纹盘鲍[16]、日本沼虾[28]、中国对虾[20]腹部锌铜含量的研究结果一致。

AKP是一种二聚体结构的酶，其结构维持及酶活性发挥需要镁和锌离子参与。其中，锌位于酶活性中心，是酶活性的必需基团之一[32]，参与催化作用，而镁仅起调节作用。AKP是锌元素的特征酶，主要参与降解外来生物大分子，能够良好反映生物体内的锌元素需求和利用率。本研究结果表明，方格星虫稚虫的AKP活性主要受锌元素影响，AKP活性随着饲料中锌添加量的增加呈先增后趋于平稳的变化趋势，与许明珠等[13]研究单一锌元素对方格星虫稚虫AKP活性影响获得的结果一致；在不同饲料铜水平下，高锌添加量处理组方格星虫稚虫的AKP活性均显著高于低锌添加量处理组，其原因可能在于适当增加饲料中的锌含量能保证方格星虫体内富集更多锌离子结合AKP锌位点，从而增强AKP活性[11]。本研究中，饲料中添加高铜和适量锌处理方格星虫稚虫的AKP活性显著高于添加低铜和适量锌处理，与其他学者对皱纹盘鲍[16]、日本沼虾[28]的研究结果一致。这可能与锌是铜的拮抗物有关，增加饲料中的锌含量可降低方格星虫对铜的吸收量，进而降低高铜引起的氧化胁迫[33]。

4 结 论

饲料中添加铜和锌均可影响方格星虫稚虫生长、体成分组成、体内元素分布和积累，以及AKP活性。饲料中锌元素对方格星虫稚虫生长的影响大于铜元素，饲料高铜添加量不影响方格星虫稚虫对锌的吸收。以增重率为评价标准，方格星虫稚虫饲料中的最适铜和锌添加量分别为20.0和40.0 mg/kg，饲料中对应的蛋氨酸铜和蛋氨酸锌添加量分别为117.6和42.1 mg/kg。