外周血CD4+／CD8+与脓毒症患者肠道菌群的关联性

邢广栋，王晓娟

（濮阳市人民医院检验科，河南 濮阳 457000）

脓毒症为感染引起的全身炎症反应综合征，严重时可累及肝、肾、心、肺、胃肠道、免疫等系统，可引起机体多器官功能障碍综合征，发病率和病死率均较高。有研究指出，免疫紊乱为脓毒症发生发展的关键因素之一，其患者免疫功能表现为促炎、抑炎状态的阶段性演变［1］。在脓毒症发生过程中，机体处于免疫系统功能不全状态，在发病初期，可引起大量炎症介质分泌，之后随着病情加重，机体可经历免疫抑制阶段，造成机体对病原体易感性增加的现象。严重脓毒症和（或）脓毒性休克时，肠道可出现肠黏膜屏障功能损伤、肠道菌群失调等症状，且引起的肠道菌群失调可反作用于机体，促进器官衰竭［2］。但目前对脓毒症患者免疫功能与肠道菌群的相关性研究较少。基于此，本研究选取82例脓毒症患者作为研究对象，以探讨外周血CD4+／CD8+与肠道菌群的关联性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年10月至2021年4月濮阳市人民医院收治的82例脓毒症患者作为研究对象，纳入观察组。同期选取69例健康体检者作为健康对照组。健康对照组：女25例，男44例，年龄30～58（44.51±6.28）岁。观察组：女33例，男49例，年龄34～59（46.82±5.73）岁，菌群紊乱程度为Ⅰ度23例，Ⅱ度37例，Ⅲ度22例。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。研究对象均签署知情同意书。

1.2 纳入标准及排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）观察组符合脓毒症相关诊断标准［3］；（2）精神正常，能配合研究；（3）心肺功能正常；（4）认知、读写功能正常。

1.2.2 排除标准 （1）溃疡性结肠炎等肠道疾病；（2）合并严重传染性疾病；（3）肝、肾功能异常；（4）合并糖尿病、自身免疫性疾病；（5）伴有过敏性疾病；（6）伴有动脉粥样硬化。

1.3 检测方法

1.3.1 血液标本 采集两组外周血液标本约5 mL，采用乙二胺四乙酸二钠进行抗凝，加入T淋巴细胞亚群标记的单克隆抗体，避光，在室温状态下染色，时间10 min，然后进行PBS洗涤，弃除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，之后使用肝素抗凝，采用流式细胞仪（美国BD公司，FACS420型）测定T淋巴细胞亚群水平，包括CD4+、CD8+、CD3+，然后计算CD4+／CD8+。

1.3.2 粪便标本 采集两组新鲜粪便约1 g，加入PBS缓冲液，使用离心机分离，转速13 000 r·min-1，时间15 min，半径8 cm，提取上清液，取沉淀并抽提基因组DNA，设计菌群特异性引物并扩增，然后根据扩增曲线计算双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌数目，结果以logCFU·g-1表示。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件处理数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，采用Pearson进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平观察组外周血CD4+、CD4+／CD8+、CD3+水平较健康对照组低，CD8+水平较健康对照组高（P＜0.05）。见表1。

表1 两组CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平比较（±s）

表1 两组CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平比较（±s）

组别例数CD4+／%CD8+／%CD4+／CD8+CD3+／%健康对照组 69 46.02±5.33 20.55±2.96 2.24±0.31 64.17±3.95观察组82 35.89±4.67 30.14±3.72 1.25±0.26 44.86±3.71 t 12.446 17.295 21.345 30.932 P ＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌计数

观察组双歧杆菌、乳酸杆菌计数较健康对照组低，大肠杆菌、肠球菌计数较健康对照组高（P＜0.05）。见表2。

表2 两组双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌计数对比（±s，logCFU·g-1）

表2 两组双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌计数对比（±s，logCFU·g-1）

组别例数 双歧杆菌计数乳酸杆菌计数大肠杆菌计数 肠球菌计数健康对照组 69 10.52±0.91 10.08±0.93 9.02±1.14 6.98±0.7 1观察组82 8.13±0.79 7.95±0.76 12.14±2.03 9.05±0.86 t 17.275 15.488 11.346 15.937 P ＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 不同菌群紊乱程度脓毒症患者CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平不同菌群紊乱程度脓毒症患者外周血CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅰ度菌群紊乱患者外周血CD4+、CD4+／CD8+、CD3+水平最高，CD8+水平最低（P＜0.05）。见表3。

表3 不同菌群紊乱程度脓毒症患者CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平比较（±s）

表3 不同菌群紊乱程度脓毒症患者CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平比较（±s）

注：与Ⅱ度比较，a P＜0.05，与Ⅲ度比较，b P＜0.05。

菌群紊乱程度例数CD4+／%CD8+／%CD4+／CD8+CD3+／%Ⅰ度23 39.25±3.97 25.86±2.65 1.52±0.21 52.48±3.71Ⅱ度37 35.16±3.38a 26.43±3.01a 1.33±0.18a 43.96±4.06aⅢ度22 33.61±2.94ab 40.85±3.92ab 0.83±0.07ab 38.41±3.10a F 16.554 169.834 102.198 82.045 P ＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 相关性脓毒症患者外周血CD4+、CD4+／CD8+、CD3+水平均与双歧杆菌、乳酸杆菌计数呈正相关，与大肠杆菌、肠球菌计数呈负相关（P＜0.05）；CD8+水平与双歧杆菌、乳酸杆菌计数呈负相关，与大肠杆菌、肠球菌计数呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、CD3+水平与粪便菌群的相关性

3 讨论

肠道是机体最大的细菌及其毒性产物的储存场所。在正常情况下，细菌及其毒性产物不会对机体造成危害，但在病理情况下，可通过受损肠黏膜屏障迁移至肠系膜淋巴组织、淋巴液、肠外组织器官、血液等，引起肠源性脓毒症，甚至诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征。脓毒症、脓毒症休克为临床重症监护室患者死亡的主要原因之一，肠道菌群为脓毒症发生、发展过程中重要的参与者，其紊乱后会激活肠道黏膜免疫，进而影响周身免疫系统，诱发或加剧脓毒症。脓毒症诱发的肠损伤可加重肠源性感染，促进脓毒症发展［4］。许雄等［5］研究得出，肠黏膜屏障、细菌易位、肠道菌群失衡间相互作用、相互影响，可共同参与肠源性脓毒症的发生、发展。同时，王蓓等［6］指出，肠道菌群为脓毒症发生的重要参与者，其紊乱可激活肠道黏膜免疫，影响机体免疫系统，诱发、加剧脓毒症，并认为肠道微生物可通过“肠道-器官”轴参与到脓毒症的发生、发展过程。

双歧杆菌、乳酸菌等有益菌能抑制部分致病菌定植、生长、繁殖，调节黏膜局部、全身免疫反应及代谢功能，提高肠黏膜屏障功能，但发生脓毒症时，机体肠道微生态遭受破坏，肠道菌群失调，肠道菌群数量、比例改变。刘丹等［7］研究发现，脓毒症患者假丁酸弧菌属、瘤胃球菌属、厌氧棒状菌属等有益菌属减少，致病葡萄球菌属、肠球菌属增加。ICU内脓毒症患者出现肠道菌群紊乱，表现为菌群结构改变、多样性下降、有益共生菌减少、专性厌氧菌减少、兼性厌氧菌增多、机会致病菌增多。双歧杆菌、乳酸杆菌为健康群体肠道中优势菌群。双歧杆菌在肠道内发酵后，可产生醋酸、乳酸，能提高机体钙磷铁利用率，防治心血管疾病，保护肝脏。乳酸杆菌能促使糖类发酵产生乳酸，从而维护机体健康，调节免疫功能。肠球菌、大肠杆菌为次要菌群。肠球菌为院内感染的重要病原菌，可引起危及生命安全的炎症疾病。大肠杆菌为机会致病菌，在机体免疫力下降时可移位，诱发相应部位感染。

本研究结果显示，观察组外周血CD3+、CD4+、CD4+／CD8+、乳酸杆菌、双歧杆菌计数水平均较健康对照组低，CD8+、大肠杆菌、肠球菌计数水平均较健康对照组高。这提示脓毒症患者肠道菌群、外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+均存在异常表达的情况。同时，本研究中不同菌群紊乱程度脓毒症患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+水平比较有差异，且Ⅰ度菌群紊乱患者外周血CD3+、CD4+、CD4+／CD8+最高，CD8+最低，与杨银娟等［8］研究结果一致。这表明脓毒症患者肠道菌群紊乱程度与外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+水平具有相关性。有研究指出，脓毒症与免疫机制紊乱紧密相关［9］。脓毒症发生时，机体内免疫细胞凋亡异常引起免疫抑制，造成T淋巴细胞亚群计数、比率改变，且在脓毒症患者处于免疫抑制状态时，机体无法对病原体感染进行特异性免疫反应调控，从而加重感染，引起器官功能障碍，甚至导致死亡［10］。T淋巴细胞是维持肠道免疫稳态的执行者，而肠道菌群及其代谢产物可从多方面对其造成影响，同时肠道菌群及其代谢产物之间通过相互作用来维持肠道稳态。根据T淋巴细胞免疫效应功能，可将其分为细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞；根据是否表达CD4、CD8分子，可将T淋巴细胞分为CD4+T细胞、CD8+T细胞。CD4+表示成熟T淋巴细胞总值，CD8+在免疫反应中直接介导被病原体感染的细胞的杀伤、破坏过程。CD8+T淋巴细胞构成的上皮内淋巴细胞主要位于肠道上皮细胞基底外侧处，具有感知肠道病原体、维持肠道屏障稳定的重要作用［11-12］。此外，肠道菌群通过调节T淋巴亚群分化、增殖、细胞因子分泌等改变肠道免疫系统状态，辅助性T细胞1／辅助性T细胞2比率失调伴随菌群失衡为多种疾病的发病基础［13］。因此，本研究认为外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+表达水平与脓毒症患者肠道菌群表达水平可能存在相关性。进一步行相关性分析，结果发现，外周血CD3+、CD4+、CD4+／CD8+均与双歧杆菌、乳酸杆菌计数呈正相关，与大肠杆菌、肠球菌计数呈负相关，CD8+与双歧杆菌、乳酸杆菌计数呈负相关，与大肠杆菌、肠球菌计数呈正相关。这提示脓毒症患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+表达水平与肠道菌群紧密相关。脓毒症会引起机体出现全身炎症反应，引起特异性免疫功能减退，CD8+水平降低，同时全身炎症反应也会造成杯状细胞功能减退，诱发肠道损伤。

脓毒症患者肠道菌群和外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+水平均存在异常表达的情况，且外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+表达水平与肠道菌群存在相关性。