食管癌高发人群血浆游离DNA中的p 38MAPK基因检测研究

冯志寅，吴怡娴，哈晓丹，陈邬锦，李秀梅，董娟娟，*

(1．新疆医科大学第一附属医院病理科，新疆 乌鲁木齐 830011；2．新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在癌症死亡原因中居第4位[1]。食管癌有两种主要病理类型：食管鳞状细胞癌和食管腺癌，其中食管鳞状细胞癌是包括中国在内的发展中国家最常见的组织类型[2]。近年来研究发现，饮酒、吸烟、水果摄入不足、身体质量指数(body mass index，BMI)偏高是食管癌的主要危险因素[3]。由于民族生活习惯和遗传背景的不同，食管癌发病情况在种族方面有较大差异，我国部分少数民族食管癌流行病学统计结果表明，新疆哈萨克族的食管癌发病率及病死率最高[4]。因此寻找肿瘤诊断标记物并发现食管癌高发人群中极具代表意义的哈萨克族食管癌高发的差异性分子，探讨其临床病理联系，对临床诊断和靶基因治疗等具有重要的意义。

血浆游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是一种外周血中游离于细胞之外的DNA。肿瘤来源的cfDNA也称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA中的核酸序列与组织样本来源的肿瘤特异性核酸序列保持着高度的一致性，且ctDNA的检测只需抽取外周血，即可从血浆或血清中提取到，对患者不造成创伤，操作方便快捷，并能够反复获取，易于实时监控。因此，通过分析ctDNA中一些特定基因的遗传学变化，对肿瘤治疗进行预后监测具有重要意义。p38MAPK是MAPK途径的下游丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶家族成员，可调节包括细胞增殖、分化，炎症和应激效应等多种细胞活动过程。p38MAPK在细胞恶性转化程度高，侵袭能力强时高表达。因此，检测哈萨克族食管癌患者血液ctDNA中是否含p38MAPK基因，将有助于我们判断肿瘤恶性程度、治疗效果和预后。

1 材料与方法

1.1 病例和对照

选取新疆医科大学第一附属医院2018年12月—2021年1月收治的20例哈萨克族食管癌患者手术治疗前及肿物切除后的清晨空腹外周静脉血标本作为实验组，10例健康哈萨克族人群的外周静脉血标本作为对照组。实验组年龄40～71岁，平均年龄61岁；男15例，女5例；肿瘤按国际TNM分期(UICC，2009年)，I期2例，II期7例，III期7例，IV期4例；低分化6例，中分化6例，高分化8例。纳入标准：①按照2010版WHO诊断标准，经病理确诊的食管鳞状细胞癌；②临床相关资料完整；③相关检查排除多发性癌；④在新疆医科大学第一附属医院行食管癌根治术。排除标准：①患者曾进行过新辅助治疗；②局部复发患者；③初次确诊时即有转移的患者；④术后病理诊断为非食管鳞状细胞癌；患者未签署知情同意书；⑤患者联系方式缺失。本次研究所有患者及家属对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 方 法

1.2.1 试剂与仪器血清/血浆游离DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)，抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒、山羊血清溶液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，兔抗人p38MAPK蛋白单克隆抗体(武汉博士德公司，1∶100稀释)，超微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo nanodrop 2000)，梯度PCR仪(美国BIO-RAD T100)。

1.2.2 样本的采集及处理抽取哈萨克族食管癌患者手术治疗前、肿物切除后的清晨空腹外周静脉血及健康哈萨克族人群的外周静脉血10 mL，放入专用的含EDTA抗凝血剂和细胞防腐剂的BCT管中，轻轻倒转8～10次，常温下保存和运输，2 h内进行离心处理(2 000 g离心10 min，取上清，8 000 g离心10 min)分离血浆，血浆样本量不低于2 mL。

组织标本取哈萨克族食管癌患者肿物切除后的石蜡切片标本，储存于-20℃冰箱待用。

1.2.3 cfDNA的提取参照血清/血浆游离DNA提取试剂盒说明书步骤进行提取，提取的DNA使用超微量核酸蛋白测定仪检测其浓度和纯度，D(260)/D(280)的比值需在1.80～2.00为合格。

1.2.4 PCR法检测cfDNA中p38MAPK基因按照表1所示配制总体积为25μL的PCR反应液，其引物序列由北京华大公司设计和合成，见表2。反应体系先94℃预变性5 min；然后94℃、1 min，55℃、30 s，72℃、1 min，共30个循环；最后72℃退火10 min。取PCR反应产物10μL，加2μL上样缓冲液，于2%琼脂糖凝胶进行电泳(TBE缓冲液，100 V)，待指示条带移动到凝胶2/3以上时，停止电泳，于凝胶成像仪观察分析产物长度。

表1 检测p38MAPK基因的PCR反应体系

表2 检测p38MAPK基因的PCR引物序列

1.2.5 组织标本中p38MAPK蛋白表达免疫组化检测使用抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒检测p38MAPK蛋白表达。石蜡包埋组织切成4μm厚度切片，首先在EDTA抗原修复液中处理，脱蜡脱水后用山羊血清溶液封闭处理。然后采用兔抗人p38MAPK蛋白单克隆抗体进行处理，将载玻片在4℃下避光孵育18 h。充分洗涤后用二抗处理组织切片1 h，洗涤后加DAB显色液至覆盖完全。充分显色后终止并采用苏木精复染，中性树胶封片，镜下观察。

1.2.6 免疫组化评分判定及比较两位病理医师独立按免疫反应评分(immunoreactivity score，IRS)判别染色是否为阳性[5]。以显色强度×阳性细胞百分比计数为最终总评分(0～9分)记录相关组织切片资料，以大于等于6分为阳性结果。显色强度计数：无染色为0分；细胞核、细胞膜或细胞质出现黄色颗粒高于背景为1分；细胞核、细胞膜或细胞质出现浅棕黄色的颗粒高于背景为2分；细胞核、细胞膜或细胞质出现深棕黄色颗粒为3分。阳性细胞百分数计数：每例免疫组化切片随机观察5个视野，随机计数100个细胞，阳性细胞数≤l%为0分；＞1%～25%(含)为1分；＞25%～50%(含)为2分；＞50%为3分。

收集手术后的20例哈萨克食管癌患者的临床病理报告，根据患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤最大径、T分期进行分组，分别比较p38MAPK蛋白的阳性表达率在不同组间的差异。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行，计量资料以±s表示并进行正态性检验，服从正态性分布的资料两组间比较采用两个独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料采用Pearson卡方检验，对个别频数过小(≤5)的计数资料采用Fisher确切概率法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血液样本的cfDNA含量检测情况

哈萨克族食管癌患者手术治疗前血液中cfDNA浓度为(0.39±0.20)ng/μL，手术后血液中cfDNA浓度为(0.32±0.18)ng/μL，健康哈萨克族人群的外周静脉血中cfDNA浓度为(0.13±0.82)ng/μL。3组人群血液中cfDNA浓度差异显著(F=7.54，P＜0.05)，其中哈萨克族食管癌患者手术治疗前与肿物切除后的血液中cfDNA浓度差异无统计学意义(P＞0.05)，哈萨克族食管癌患者手术治疗前、手术后血液中cfDNA浓度均高于健康哈萨克族人群，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见图1。

图1 哈萨克族食管癌患者手术前后和对照人群血液中的cfDNA水平

2.2 cfDNA中p38MAPK基因检测结果

PCR法检测出20例哈萨克族食管癌患者手术治疗前cfDNA中含p38MAPK基因17例，检出率85%；手术后cfDNA中含p38MAPK基因15例，检出率75%；10例健康哈萨克族人群的cfDNA中含p38MAPK基因3例，检出率30%。3组人群cfDNA中p38MAPK基因检出率有显著差异(χ2=9.00，P＜0.05)，其中手术治疗前人群cfDNA中p38MAPK基因检出率显著高于健康人群组(P＜0.05)，手术后cfDNA中p38MAPK基因检出率与健康人群组差异无统计学意义(P＞0.05)，手术切除肿物前、后cfDNA中p38MAPK基因检出率差异亦无统计学意义(P＞0.05)，详见表3。

表3 cfDNA中p38MAPK基因检测情况

2.3 手术后组织标本中p38MAPK蛋白免疫组化检测结果

对20例哈萨克族食管癌患者术后石蜡包埋组织进行临床病理指标分析，免疫组化提示p38MAPK蛋白在高、中分化组的阳性表达率高于低分化组，差异有统计学意义(χ2=13.939，P＜0.05)。在肿瘤最大径≤2.5 cm组中的阳性表达率高于＞2.5 cm组，差异有统计学意义(χ2=0.014，P＜0.05)。p38MAPK蛋白的阳性表达率在年龄、性别、T分期之间的表达差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2和表4。

表4 哈萨克族食管癌患者组织中按临床病理指标分组的p38MAPK蛋白表达水平分析

图2 哈萨克族食管癌患者p38MAPK蛋白表达的免疫组化评分示例图

3 讨论

食管癌早期不易诊断，患者出现吞咽困难或胸骨后疼痛等症状时常已处于晚期，病死率高。我国食管癌的发病率具有明显的地域性和民族特异性，其中哈萨克族发病率为全国各民族发病率最高，并且具有显著的家族聚集现象[6]。因此寻找肿瘤诊断标记物并发现哈萨克族食管癌高发的差异性分子，探讨其临床病理联系，对临床诊断和靶基因治疗等具有重要的意义。ctDNA来源于机体所有荷瘤部位，包括肿瘤原发灶、转移灶，甚至微小残留病灶[7]。肿瘤细胞在凋亡和坏死的过程中可释放DNA进入循环中，即ctDNA，是cfDNA的一部分。cfDNA的检测属于液态活检范畴，具有创伤小、安全、可避免肿瘤内取样异质性等优点[8]。另外，通过治疗过程中的连续采样，cfDNA可早于影像学检查预测和动态监测治疗效果[9]。本次研究发现食管癌高发人群中哈萨克族食管癌患者手术治疗前、手术后血液中cfDNA浓度均高于健康哈萨克族人群，提示血液cfDNA含量的测定可用于早期肿瘤筛查。

p38MAPK作为MAPK途径的下游丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶家族成员在细胞的恶性转化中涉及了：生长信号的自我维持、无限的复制潜能、抗细胞凋亡、血管生成、以及组织浸润和转移，在哺乳动物的各组织细胞中广泛的低表达[10]。Gao等[11]通过对肝癌细胞系HepG2研究发现，血管生长因子可通过p38MAPK相关通路增加该细胞系的异质性黏附作用，从而增强肿瘤细胞的侵袭力。陈红芳等[12]通过对乳腺癌细胞系MDA-MB-231研究发现，JAK酶抑制可以通过阻断p38MAPK而抑制该细胞系的侵袭力，也间接表明p38MAPK与肿瘤细胞侵袭存在相关性。结合以上，p38MAPK在细胞恶性转化程度高，侵袭能力强时高表达。本研究通过对哈萨克族食管癌患者组织标本中p38MAPK免疫组化检测情况可知高、中分化组p38MAPK蛋白的阳性表达率高于低分化组，肿瘤最大径≤2.5 cm组高于＞2.5 cm组。该结果不仅说明p38MAPK在食管鳞状上皮细胞发生恶变时表达显著提高，而且提示了p38MAPK的表达可能在低分化食管癌中有所缺失，抑或随着分化程度的降低，肿瘤细胞从信号通路的多样性中受益来调控多重的细胞过程[13]。20例食管癌高发人群哈萨克族患者手术治疗前cfDNA中p38MAPK基因表达检出率显著高于健康人群组(P＜0.05)，结合cfDNA中特异性基因表达变化与肿瘤负荷变化趋势一致，动态监测cfDNA中特定基因的存在可帮助筛查肿瘤发生和肿瘤治疗后隐匿性转移，因而说明监测食管癌患者血液cfDNA中p38MAPK基因可为临床治疗判断肿瘤恶性程度、预后情况提供一定的判定依据。但在低分化食管癌中p38MAPK的作用机制尚需进一步研究。

综上所述，食管癌高发人群中哈萨克族食管癌患者血液中cfDNA浓度显著高于健康哈萨克族人群，可作为食管癌诊断和化疗疗效预测的一个潜在指标，具有重要的临床应用潜力。但由于本研究样本偏小，研究结果需要进一步扩大样本验证。哈萨克族食管癌患者血液cfDNA中p38MAPK基因表达检出率显著高于健康人群组，说明检测食管癌患者血液中cfDNA中是否含p38MAPK基因，将有助于我们判断肿瘤恶性程度、治疗效果和预后，进而为揭示cfDNA中p38MAPK基因能否作为检测食管癌病情的新型分子标志物作一初步探讨。

目前关于食管癌中cfDNA的研究还比较少，但国内外现有的各种分析结果表明cfDNA检测在食管癌早期诊断、监测和预后是非常有潜力的非侵入性检测技术[14]。在未来的研究中可通过扩大样本量、结合患者治疗不同阶段及生存分析验证研究结果，深入探讨cfDNA中p38MAPK基因及其变异检测在食管癌筛查、治疗过程中与肿瘤负荷之间的关系。