甘草干姜汤抗小鼠乳腺癌实验研究

辛雨濛，梁桓熙，孙震晓

(北京中医药大学生命科学学院，北京 102488)

据世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)发布的2020年全球最新癌症数据显示，乳腺癌发病率高于肺癌，成为全球第一大癌症[1-2]。乳腺癌多发生于乳腺导管上皮或腺小叶，是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控造成的[3-5]。现阶段治疗乳腺癌主要以手术治疗为主，配合以放疗、化疗、内分泌治疗等，但术后易复发，放化疗易造成不良反应，利用中医中药治疗既是一种辅助治疗手段，又可明显改善患者体质，减少复发转移可能，降低化疗放疗的毒副作用，有效延长患者的生存期[6-8]。

甘草干姜汤(licorice and dried ginger decoction，LDGD)来自张仲景《伤寒杂病论》和《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气脉证治》。甘草甘温而补中益气，干姜辛温而温复脾肺之阳，全方躁烈性不强、药性平和、具有补中复阳之功。乳腺癌在中医常归为“乳癌”“石榴翻花发”“乳岩”“乳石”“乳毒”“奶岩”等。现代中医治疗乳腺癌多为补虚益肾，疏肝健脾，行气养血，与肝经、脾经、肾经的关系最为密切[9]。因此甘草干姜汤可能用于乳腺癌的治疗。本实验以荷小鼠乳腺癌细胞4T1的小鼠模型为研究对象考察甘草干姜汤的抗乳腺癌作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

1.1.1 LDGD的制备甘草、干姜等饮片购自安国市昌达中药材饮片有限公司(甘草批号1801001，干姜批号1806001)。称取甘草饮片30 g，干姜饮片15 g，加入450 mL纯水，将中药药材投入圆底烧瓶，使用加热回流的方式进行提取，从微沸时开始计时，2 h后转移药液，再加入360 mL纯水进行提取，从再次微沸时开始计时，1.5 h后与之前药液合并，离心除渣后利用旋转蒸发仪浓缩，将浓缩后的药液置于-80℃预冻，过夜后使用冻干机，冻干48 h，得到中药冻干粉。根据最后所得冻干粉的质量和生药量来计算冻干粉得率。

根据生药量计算所需冻干粉的质量，精密称取LDGD冻干粉，溶于相应体积的纯水中，室温震荡溶解后，密封于4℃冰箱保存。

1.1.2 实验试剂RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。DMSO、NCTD均购自Sigma公司；青霉素、链霉素溶液均购自Amresco公司；胰蛋白酶购自北京拜尔迪生物科技有限公司。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)购自Ameresco公司，氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氢氧化钠(NaOH)均购自北京化学试剂公司。

1.1.3 RPMI-1640完全培养基按照RPMI-1640培养基粉剂说明书进行配制，每1 L培养基中加入2.0 g NaHCO3，使用1 mol/L的NaOH/HCL调节pH至7.2～7.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，使用前加入青霉素、链霉素和胎牛血清，4℃保存。

1.1.4 PBS缓冲液称取0.2 g KCl、8 g NaCl、3.48 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KH2PO4，加1 L双蒸水，搅拌溶解，1 mol/L NaOH调节pH至7.2～7.4，121℃、30 min灭菌，4℃保存备用。

1.1.5 胰蛋白酶量取100 mL PBS缓冲液，称取0.25 g胰蛋白酶粉末溶解于PBS中，滴加2%酚红两滴，以1 mol/L的NaOH调节pH至8.0，加入0.02 g EDTA-Na2，0.22μm微孔滤器过滤除菌，得到含0.02%EDTA、0.25%的胰蛋白酶，4℃保存。

1.2 细胞系及动物

小鼠乳腺癌细胞4T1，来自本课题组，-80℃冻存；BALB/c雌性小鼠，购自北京斯贝福公司，合格证号SCXK(京)2019-0010。

1.3 主要仪器

低温高速离心机和微量移液器，购于Eppendorf公司；电子天平，购于Mettler Toledo公司；高压蒸汽灭菌锅(AUTOCLAVE)，购于Sanyo公司；超低温冰箱，购于美国Sanyo公司；倒置显微镜(TE2000-S)，购于Nikon公司；；低速轨道式摇床(SK-L330-Pro)，购于大龙兴创实验仪器(北京)股份公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞复苏培养基放置至室温，调节水浴锅温度稳定至37℃。将细胞自-80℃超低温冰箱中取出，置于37℃水浴锅中轻晃融化。在超净台内取无菌15 mL离心管，加入4 mL培养基，吸取融化的细胞悬液沿离心管壁缓慢加入，轻轻吹打混匀，1 000 r/min离心2 min。离心后弃去上清，加入1 mL培养基轻轻将细胞吹打均匀，取一个新的细胞培养瓶加入5 mL新培养基，将细胞悬液转移至新培养瓶中，置于37℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养。

1.4.2 4T1荷瘤小鼠模型的建立对小鼠乳腺癌细胞4T1进行体外细胞扩大培养，满足实验需求细胞数量，使用前进行消化、计数后重悬于PBS中，使用接种针将细胞悬液注射于小鼠右前肢腋下，每只小鼠接种1×106个细胞，每只0.2 mL。正常对照组在小鼠右前肢腋下注射等量的PBS。

1.4.3 给药方案38只雌性BALB/c小鼠共分5组：正常对照组6只，模型对照组和LDGD低、中、高剂量组每组8只。从接瘤后次日起，LDGD低、中、高剂量组小鼠分别按0.1、0.3、0.9 g/kg灌胃给药，每日1次，根据小鼠体质量对灌胃体积进行微调，使每只小鼠的灌胃体积均在0.2 mL左右。正常对照组、模型对照组灌胃蒸馏水，连续20 d。

1.4.4 指标检测实验过程中每天记录小鼠体质量的变化，从第10天开始使用游标卡尺对肿瘤组织的最长径(a/mm)和最短径(b/mm)进行测量，用于计算肿瘤体积：瘤体积=1/2×a×b2。共给药20 d，第20天给药后禁食12 h，次日最后一次给药后称体质量，摘取眼球取血，4℃、3 000 r/min离心15 min收集血清，用于检测肝肾生化指标：白蛋白(ALB)、血清碱性磷酸酶(ALP)、丙谷转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌 酐(CRE)、直 接 胆 红 素(DBIL)、尿 酸(UA)。剥离肿瘤并解剖取其肝脏、肾脏、胸腺、脾脏组织，称质量记录。

1.4.5 肿瘤组织病理切片HE染色肿瘤组织4%多聚甲醛进行固定。将固定好的肿瘤组织进行石蜡包埋、切片、HE染色。染色后的肿瘤组织切片显微镜下观察。HE染色后，苏木素可将细胞核染成蓝色，伊红可将细胞质染成粉红色。

1.5 数据处理及统计学分析

实验数据采用SPSS 24和Graphpad Prism 7软件进行统计学分析，数据用±s表示，使用单因素方差分析对多样本均数进行比较，使用t检验对两样本均数进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

各组荷瘤小鼠剥离的肿瘤见图1，可以看出，甘草干姜汤高剂量组小鼠的肿瘤体积显著小于模型组。记录给药后第2～20天荷瘤小鼠体质量的变化(表1)，甘草干姜汤各剂量组与模型对照组相比差异无统计学意义。从第10天开始测量并记录肿瘤体积变化，如表2所示，模型对照组肿瘤生长速度较快，体积较大，而甘草干姜汤给药组的肿瘤体积随着剂量的增加逐渐减小，生长速度变缓。

表2 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠肿瘤体积的影响

图1 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

表1 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠体质量的影响

剥离肿瘤后对肿瘤质量进行分析(表3)，结果显示与模型对照组相比，甘草干姜汤高剂量组显著抑制了小鼠肿瘤的生长，抑瘤率为(44.76±0.06)%(P＜0.01)，中剂量组抑瘤率为(15.68±0.21)%(P＜0.05)，而模型对照组、甘草干姜汤低剂量的肿瘤质量差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠肿瘤质量的影响

2.2 甘草干姜汤作用后4T1荷瘤小鼠病理组织切片分析

荷瘤小鼠肿瘤组织切片HE染色后观察(图2)，可见与模型对照组相比，甘草干姜汤高剂量组的肿瘤坏死区域面积显著增多，坏死区域肿瘤细胞存在细胞核固缩现象。

图2 肿瘤组织切片HE染色分析

2.3 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠免疫功能的影响

与正常对照组相比，模型组和LDGD各剂量组的脾脏系数均显著增加，但LDGD低、中剂量组的脾脏系数、胸腺系数与模型对照组比均无明显变化；LDGD各剂量组的脾脏系数随浓度增加逐渐减小，LDGD高剂量组的脾脏系数与模型对照组相比显著降低(表4)。

表4 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠免疫器官的影响

2.4 甘草干姜汤对4T1荷瘤小鼠肝脏、肾脏功能的影响

与正常对照组相比，模型对照组和LDGD各剂量组的肝脏系数均显著增加；但LDGD各剂量组的肝脏系数、肾脏系数与模型对照组比无明显变化(表5)。与正常对照组相比，模型对照组和LDGD各剂量组的ALP、ALT、CRE水平降低，BUN水平升高，而与模型对照组相比，LDGD各剂量组的各指标均无显著性差异(表6)，LDGD对小鼠肝肾功能指标均无明显影响。

表5 甘草干姜汤对荷乳腺癌4T1小鼠肝肾系数的影响

表6 甘草干姜汤对荷小鼠乳腺癌4T1小鼠肝肾血生化指标的影响

3 讨论

本研究结果表明，LDGD可以抑制4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长。给药20 d后，GDLD高剂量组荷瘤小鼠的肿瘤体积比模型组显著减小，对肿瘤质量的抑制率可达(44.76±0.07)%；GDLD各剂量组小鼠体质量与模型组相比差异无统计学意义，肿瘤组织病理切片分析表明GDLD高剂量组的肿瘤坏死区域面积显著增多；LDGD低、中剂量组的脾脏系数、胸腺系数与模型对照组相比没有明显变化，说明药物自身对小鼠的胸腺和脾脏影响不大，而LDGD各剂量组的脾脏系数随浓度增加逐渐减小，LDGD高剂量组的脾脏系数与模型对照组有显著差异，说明LDGD有助于小鼠脾脏功能的恢复；与模型对照组相比，LDGD各剂量组的肝肾系数无显著性差异；与正常对照组相比，模型对照组和LDGD各剂量组的ALP、ALT、CRE水平降低，BUN、O/P水平升高，而与模型对照组相比，LDGD各剂量组的各指标均无显著性差异，说明模型对照组和LDGD各剂量组小鼠的肝肾血生化指标变化由荷瘤引起，LDGD对小鼠肝肾指标无明显影响，说明LDGD无明显肝肾毒性。上述实验结果表明，LDGD在实验剂量范围有一定抗肿瘤作用，无明显的肝肾毒性和免疫抑制作用。

目前利用甘草干姜汤研究抗肿瘤作用的实验研究较少，但有报道其作用于其他功能的研究进展。例如甘草干姜汤以0.96 g/kg的剂量，给药28 d可以调整大鼠体内Th1/Th2的比例，进而调节白介素IL-2、IL-5、IL-4、干扰素IFN-γ的表达，增强免疫功能，改善变应性鼻炎的症状[10-12]；甘草干姜汤以2 g/kg的剂量，给药28 d作用于大鼠还能提高肺组织超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，降低脂质过氧化物的水平，清除体内过多的自由基，增强抗氧化防御系统，同时调控TGF-β和SIRT1的表达，抑制肺纤维化[13-15]。

本研究初步探讨了甘草干姜汤体内抗乳腺癌作用及对主要免疫器官胸腺及脾脏、主要药物代谢器官肝脏和肾脏的作用，明确了甘草干姜汤具有一定的抗乳腺癌作用，并且无明显的肝肾和免疫毒性。本研究为甘草干姜汤临床用于乳腺癌治疗提供了一定数据支持，也有助于基于甘草干姜汤的抗肿瘤中药新药研发，下一步需结合生物信息学、药物化学和分子细胞生物学技术进一步揭示甘草干姜汤抗肿瘤的作用机制。