胸腔积液肺腺癌细胞中CXCR4、Ki67、MDM 2、N-c ad herin的表达及其与EGFR突变状态的关系

王 蕊，刘 颖，吴 娟，纪晓坤，马 阳，郭 晓，杜 芸

(河北医科大学第四医院癌检中心，河北石家庄 050011)

近年来，针对肺腺癌患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的精准治疗取得了较大进展。EGFR突变是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)治疗的一个强有力的预测因素。研究[1]表明一些临床因素如女性、不吸烟者、东亚裔与肺腺癌EGFR突变状态相关。但是，关于EGFR突变状态与肺癌细胞生物学行为(如增殖、转移等)的关系研究较少。众所周知，肿瘤细胞增殖核抗原Ki67是判断细胞活动水平的重要指标；鼠双微体2(murine double minute 2，MDM2)可作为判断肺腺癌恶性程度、转移潜能及预后的重要参考指标[2-4]；N-钙黏蛋白(N-cadherin)介导肿瘤细胞由上皮向间质转化，促进血管增殖，使细胞更易移动和浸润[5]；趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关[6-7]。因此，上述蛋白的过表达与肿瘤细胞的恶性生物学行为有关。本文拟通过研究EGFR突变状态与肺腺癌细胞中CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin表达的关系，探讨EGFR突变状态与肺腺癌生物学行为的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例和标本

选取河北医科大学第四医院2019年7—12月间收治的晚期肺腺癌患者46例，其中男性26例，女性20例；年龄37～76岁，中位年龄为63岁。送检胸腔积液标本之前，患者均未经过抗肿瘤治疗，CT提示肺恶性肿瘤，胸腔积液细胞经病理学确诊。本次实验经河北医科大学第四医院伦理委员会批准(2019MEC102)。

1.2 胸腔积液的处理

将送检的胸腔积液(100～200μL)分成两部分，一部分使用一次性病变细胞采集器，制成HE涂片2张，用于常规诊断，同时，制备14～16张防脱玻片涂片，固定在95%的酒精中，用于免疫细胞化学染色(immunocytochemistry，ICC)检测；另一部分按1 800 r/min离心2 min，留取沉淀，配制成10～15 mL的细胞悬液，-20℃保存，用于EGFR基因突变检测。

1.3 免疫细胞化学染色步骤

结合临床与影像学资料，选择NapsinA、TTF1、P40、P63、Syn、CD56、CEA、WT1等抗体诊断肺腺癌胸腔积液转移。ICC主要染色步骤：3%过氧化氢溶液浸泡10 min，柠檬酸缓冲液(pH=6.0)高压处理5 min，PBS冲洗，动物非免疫血清封闭15 min，一抗室温孵育60 min或4℃过夜，PBS冲洗，二抗孵育15 min，DAB显色，苏木精复染2～3 min。本实验所有抗体均为即用型抗体，CXCR4抗体购自美国Abcam公司，其余抗体购自福州迈新公司。

1.4 EGFR基因突变检测

取400μL细胞悬液放入1.5 mL的EP管中，离心去掉上清后，用凯杰公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Micro kit)提取DNA。使用NanoDrop 2000检测DNA，保证其D(260)/D(280)值在1.8～2.0之间。EGFR基因检测使用厦门艾德生物公司的检测试剂盒(AmoyDx EGFR突变检测试剂盒)。该试剂盒采用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)技术，在ABI7500上行实时荧光定量PCR，检测人类EGFR基因外显子18～21上的突变。

1.5 细胞分组与结果判断

将患者分为EGFR突变组和EGFR野生型组，分别进行MDM2、Ki67、N-cadherin和CXCR4蛋白表达的免疫细胞化学检测。根据核染色程度评分：无染色0分，淡黄色1分，黄色或褐黄色2分，棕色和黑色3分。根据视野内着色细胞占细胞总数的百分比评分：＜10%计为0分，10%(含)～30%为1分，30%(含)～70%为2分，≥70%为3分。总评分=核染色评分×染色细胞数评分。按总评分＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.6 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行分析。计数资料采用χ2检验。应用Spearman相关系数检验进行EGFR基因突变和CXCR4、MDM2、Ki67、Ncadherin蛋白表达阳性率的相关性分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 细胞学检测

肺腺癌患者的胸腔积液肿瘤细胞NapsinA和TTF-1蛋白表达阳性，见图1、2。同时WT-1、Calretinin、CK5/6、p63、CD56、Syn等免疫标记在肺腺癌细胞中表达为阴性。46例胸腔积液细胞学诊断均为肺腺癌转移。

图1 免疫细胞化学法检测胸腔积液涂片示NapsinA阳性的肺腺癌细胞(×400)

2.2 EGFR基因检测结果

46例肺腺癌患者中，31例(67.4%)存在EGFR基因突变，其中19号外显子突变17例(37.0%)(图3)，21号外显子突变14例(30.4%)(图4)。

图3 EGFR基因19号外显子缺失突变

图4 EGFR基因21号外显子L858R突变

2.3 CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin蛋白表达与EGFR突变的相关性

免疫细胞化学法分别检测胸腔积液细胞中CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin蛋白的表达，可见部分涂片呈阳性，见图5～8。CXCR4阳性细胞为胞质或细胞膜染色，Ki67阳性细胞为核染色，MDM2阳性细胞为胞质或细胞核染色，N-cadherin阳性细胞为细胞浆和细胞膜染色。我们分析了肺腺癌细胞中CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin表达阳性率与EGFR突变的相关性，结果见表1。31例EGFR突变患者中23例(74.2%)CXCR4染色阳性，20例(64.5%)MDM2染色阳性，24例(77.4%)Ki67染色阳性，25例(80.6%)N-cadherin染色阳性；15例EGFR野生型患者中4例(26.7%)CXCR4染色阳性，3例(20%)MDM2染色阳性，5例(33.3%)Ki67染色阳性，4例(26.7%)Ncadherin染色阳性。CXCR4、MDM2、Ki67和Ncadherin蛋白表达阳性率与EGFR突变呈正相关(rCXCR4=0.452，rMDM2=0.417，rKi67=0.428，rN-cadherin=0.524；均 为P＜0.05)，EGFR敏感突变组CXCR4、Ki67、MDM2、N-cadherin蛋白阳性表达率明显高于EGFR非突变组(P＜0.05)。

表1 肺腺癌恶性胸腔积液细胞CXCR4、N-cadherin、Ki67、MDM2蛋白表达阳性率与EGFR突变的相关性分析

图5 CXCR4蛋白表达阳性的肺腺癌恶性胸腔积液细胞(ICC，×400)

图6 Ki67蛋白表达阳性的肺腺癌恶性胸腔积液细胞(ICC，×400)

图8 N-cadherin蛋白表达阳性的肺腺癌恶性胸腔积液细胞(ICC，×400)

3 讨论

晚期肺癌产生恶性胸腔积液的患者，肺癌类型以腺癌为主，所以恶性胸腔积液中检测癌细胞EGFR基因突变率也应该略高于非小细胞肺癌的EGFR基因突变率。本次实验肺腺癌恶性胸腔积液的EGFR突变率为67.4%，与之前已有的恶性胸腔积液细胞的EGFR突变报道(66.3%)[8]相近。此外，本实验的晚期肺腺癌患者中，19号外显子突变较21号外显子突变高，与Gao等[8]的研究一致。Ning等[9]研究已经表明，在胸膜转移的患者中更容易发生EGFR基因19号外显子突变。在预后生存方面，有研究[10-11]表明，肺癌EGFR突变患者的预后明显好于EGFR野生型患者。然而，也有研究表明两者没有区别[12-13]，上述观点的研究对象，均是手术切除的组织病理，无法证明EGFR突变本身是否影响肺腺癌患者术后生存。目前，尚不清楚不同EGFR突变状态在肺腺癌中是否具有不同的生物学特性，从而可能影响其预后。因此，本研究拟通过4个客观指标(CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin)来探讨EGFR突变状态与肺腺癌生物学行为的关系。

Tsai等[14]发现，携带EGFR基因L858R突变的肺腺癌，癌细胞侵袭能力增强、MPE形成增强、ERK信号通路激活、诱导CXCR4表达。有研究表明，CXCR4可促进肿瘤细胞生长，CXCR4高表达的肿瘤细胞具有更大的侵袭和转移潜能[15]。Zuo等[16]报道CRCX4过表达通过EGFR和下游信号通路增强细胞转移和侵袭。EGFR与CXCR4表达呈正相关，但未分析不同EGFR基因突变状态下CXCR4表达的差异。本研究结果表明CXCR4的表达与EGFR突变状态相关，且EGFR突变组CXCR4的表达明显高于非突变组，提示EGFR敏感突变的肺腺癌具有更强的增殖、转移能力，预后可能更差。

Ki67一直被认为是评价癌细胞增殖能力的重要标志物[17-18]。本研究发现EGFR突变组Ki67表达阳性率较高。提示EGFR突变的肺腺癌细胞恶性度和增殖能力更高。Zhu等[17]的研究也证明，在EGFR突变或野生型患者中，Ki67的表达水平与EGFR突变相关，Ki67的高表达与生存不良相关。MDM2是调节P53通路的重要基因，具有降解P53及泛素化的功能，参与肿瘤的发生、发展[19]。Liu等[20]的研究发现在非小细胞肺癌患者中MDM2表达较正常肺组织高出6倍以上，而P53表达水平则出现7倍的下降，从而导致患者疾病进展和预后不良。因此可作为判断非小细胞肺癌恶性程度，转移潜能及预后的重要参考指标。Berghmans等[21]报道MDM2在非小细胞肺癌中的表达与EGFR蛋白的表达呈正相关。有研究表明N-cadherin在肿瘤生长中被上调，且它是促进肿瘤细胞侵袭的重要因子[22]。也有许多研究证明N-cadherin参与癌细胞的侵袭和迁移，参与上皮-间质转化和肿瘤转移[23]。因此，N-cadherin的上调会导致更差的生物行为。本研究发现，EGFR突变的肺腺癌胸腔积液细胞中N-cadherin的表达高于EGFR野生型，说明EGFR突变的肺腺癌细胞可能具有更强的侵袭转移能力。目前，对于术后标本EGFR基因突变类型对肺腺癌患者预后的影响存在争议。我们的实验表明，EGFR突变的肺腺癌细胞，MDM2蛋白表达更高，提示与EGFR野生型患者相比，EGFR突变的晚期肺腺癌患者可能预后更差。

综上所述，EGFR突变状态与CXCR4、Ki67、MDM2和N-cadherin的表达阳性率相关，且EGFR突变的肺腺癌细胞们的表达更高。本次实验排除了临床治疗的影响，实验结果提示，EGFR突变型的肺腺癌患者的生物学行为更差，可能其预后更差。本次实验为我们进一步了解EGFR突变在肺腺癌发生、发展中的作用提供了帮助。