硝酸铈亚慢性暴露对大鼠神经行为功能的影响

刘健新，马宇鸿，郝卫东

(北京大学公共卫生学院毒理学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191)

稀土元素因为其独特的理化性质，被广泛应用于农业、石油化工、畜牧业、高新技术产业等行业。稀土农用可提高农作物的发芽率和存活率，提高果树的坐果率，还可促进动物生长，提高经济收益[1-3]。越来越多的稀土元素进入日常生活，并通过生物积累进入食物链，目前稀土膳食暴露是人群稀土暴露的主要途径。2007年第4次中国总膳食研究调查显示谷薯、瓜果、肉类、水产等12类膳食样品均含有较高的镧(La)、铈(Ce)等轻稀土元素[4]，江西省某地茶叶中各稀土元素检出率均超过97%，超标率为49.6%，其中铈元素含量高于其他稀土元素，达到0.85 mg/kg[5]。

铈是含量最丰富的稀土元素，在地球上的储量为0.004 6%，其质地较软，具有延展性，化学性质较活泼，在自然界中多以氧化态的形式存在，且与其他稀土氧化物共同存在于同一矿物中，难分离[6]。铈及其化合物因具有不同的特性还有一些特殊的用途，如纳米氧化铈因具有再生抗氧化活性和抗脂肪变性，在预防及治疗结直肠癌及肝细胞癌等肿瘤方面具有重要意义[7-8]；硫化铈比传统的无机染料颜色鲜艳且耐温性高[6]；添加剂硝酸铈能够提高化学镀Ni-W-P镀层的耐腐蚀性和耐磨性等[9]。一般情况下，小剂量短期接触稀土元素不会对人体健康产生明显危害，甚至具有特殊药效和保健作用，如氯化镧可被用于预防动脉粥样硬化，硝酸铈可以作为烧伤、烫伤等创面的消毒剂[10]。但人群流行病学调查显示，长期低剂量暴露稀土元素可降低稀土矿区婴幼儿的运动能力和儿童智力[11-12]。稀土矿区居民血液、头发和尿液中稀土元素均高于非矿区，其中铈含量高于其它稀土元素[13]。但目前单一稀土元素铈对神经行为影响的毒理学资料尚不够完善。

农用稀土化合物以及酸性土壤或水源可使稀土元素以离子形式存在，继而富集于动植物体内。故本次实验采用硝酸铈灌胃染毒，参照经济合作与发展组织(organization for Economic Cooperation and Development，OECD)GD-424推荐的啮齿动物神经行为毒性评价方法进行，观察硝酸铈亚慢性(90 d)暴露后大鼠行为学的改变，从情绪、学习记忆和运动平衡协调能力方面评估硝酸铈对大鼠神经行为的影响，旨在为稀土元素铈的风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 受试物及主要实验仪器

硝酸铈(Ⅲ)六水合物[Cerium(Ⅲ)nitrate hexahydrate，Ce(NO3)3·6H2O]，纯度＞99%，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。硝酸铈溶液配制：称取66.55 g硝酸铈六水合物，溶于1 L ddH2O中，即为50 mg/mL硝酸铈染毒储备液，用ddH2O将储备液进行相应稀释得到10、2 mg/mL硝酸铈染毒液。大鼠每100 g体质量给予1 mL染毒液。

本实验主要仪器包括：大鼠转棒仪(江苏赛昂斯生物科技有限公司)，大鼠旷场仪和大鼠高架十字迷宫(上海吉量科技有限公司)，大鼠Morris水迷宫(江苏赛昂斯生物科技有限公司)，ANY-maze动物行为学采集和分析系统(美国Stoelting有限公司)，Elan DRCⅡ型电感耦合等离子体质谱仪(美国Perkin-Elmer Sciex公司)，微波消解系统(意大利Milestone公司)。

1.2 实验动物处理

选择初断乳，即新生21 d(PND21)无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级SD大鼠，体质量45～60 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。大鼠适应性喂养5 d后编号，按照体质量大小排序后，采用随机数字表法分为4组，分别为正常对照组(ddH2O)，Ce(NO3)3低剂量组(20 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)和高剂量组(500 mg/kg)，每组雌、雄鼠各12只。剂量设计参考国家食品安全风险评估中心提供的硝酸铈的大鼠半数致死剂量(lethal dose 50，LD50)和未见毒性反应剂量(no observed adverse effect level，NOAEL)[14]。高剂量约为1/6 LD50，中剂量参考硝酸铈的NOALE值[75 mg/(kg·d)]。连续灌胃90 d后，进行行为学测试，且行为学测试期间持续暴露硝酸铈。动物饲养于北京大学公共卫生学院IVC动物饲养系统，相对湿度40%～70%，温度22～25℃。光照条件为12 h/12 h昼夜周期模式，大鼠自由摄食与饮水。动物实验符合北京大学动物福利与实验动物管理委员会相关规定，并通过动物实验伦理审查(LA2019053)。

1.3 旷场实验

旷场实验箱体为底壁分离，无顶盖的箱体。将5块ABS黑色塑料板围成的体积为100 cm×100 cm×50 cm的旷场装置放置于隔音房间，弱光照明。实验开始前2 h，将动物放入该房间适应环境。实验者每次于同一位置将动物放于实验箱中央位置，动物头部朝向同一个方向，实验人员离开实验装置区域后开始实验。旷场实验箱底部被分若干网格，动物在该区域自由探索5 min，记录如下活动参数：水平运动距离、中央区停留时间、进入中央区次数。动物在中央区的活动情况反映其焦虑程度，即焦虑动物中央区活动次数较少。

1.4 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫是由两个闭合壁(50 cm×10 cm)、两个开放壁(50 cm×10 cm)和中央区(10 cm×10 cm)构成的垂直十字，距离地面高50 cm，各个壁均由黑色塑料构成。实验开始前2 h，将动物放入隔音房间以适应环境。严格控制房间温度和通风。实验者每次于同一位置将动物放于中央区位置，动物头部朝向其中一个开放壁的方向，实验人员离开实验装置区域后开始实验。实验时间5 min，以动物在开臂内停留时间和进入开臂次数占总次数和总时间的百分比为主要指标评价动物焦虑情况。每只动物只测试1次，如果在实验过程中动物掉落，则剔除该数据。

1.5 转棒实验

大鼠转棒仪共6个通道，各个通道共用质地粗糙的转棒。实验开始前将动物放于速度为4 r/min的转棒上适应转棒环境1 min，直到动物不掉落。动物在适应环境后放入转棒仪，动物头部朝向同一方向，正式实验采用匀加速方式，实验时间为300 s，转速从4 r/min加速到40 r/min。记录动物在棒时间，重复测量3次，取平均值。

1.6 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫装置放置于水迷宫专用房间内，严格控制房间温度和光照。该装置为直径150 cm，高50 cm的圆形水池，池壁和底部均为黑色。水池壁上贴有正方形、长方形等白色贴纸作为动物视觉线索。水池内水深22～23 cm，恒温装置保证水温始终在(23±2)℃。圆形水池均分为4个象限，任选其中一个象限放入直径为12 cm的黑色平台，位于水平面下1～2 cm。实验包括：①定位航向实验。分别以各象限的统一位置作为起始点，动物面朝池壁，从任一象限起始点轻轻放入水池中。一个象限一次实验时间为90 s，从动物入水至四肢爬上平台的时间作为逃避潜伏期。动物爬上平台后，让其停留30 s。若在90 s内动物未找到平台，则潜伏期记为90 s，并人为引导其找到平台，并停留30 s。每天每只动物训练4次，连续训练4 d。②空间探索实验。定位航行实验结束的24 h后，移除平台。将动物面向池壁，从任一象限轻轻放入水中，记录动物在2 min内游泳速度、游泳距离、进入目标象限次数和跨越原平台次数。

1.7 海马组织中Ce元素含量的检测

行为学实验结束后，采用腹主动脉取血法处死动物，断头取脑。冰上分离双侧海马。然后取0.03 g海马组织于8 mL的石英消解管中，加入0.5 mL浓硝酸，静置2 h后，加压40 bar(氮气)进行微波消解：室温-150℃、5 min；150～190℃、5 min；190℃、20 min；功率1 200 W。消解完毕后加入内标铟(2 ng/mL)0.4 mL，定容至8 mL，摇匀后，采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定Ce元素。

仪器条件如下：雾化器流量，1.05 L/min；辅助气流量，1.80 L/min；等离子体气流量，1.85 L/min；射频发生器功率，1 180 W；驻留时间，50～100 ms；样品提升量，1.1 mL/min；扫描方式，单点跳峰；分辨率，0.7～0.9 amu。

质控样GBW09101a标样分析结果：为了考核本法的准确性，选用GBW09101人发样进行验证试验，测定结果铈元素为(20.23±0.25)ng/g，参考值为(19.7±2.6)ng/g；相对标准偏差为1.5%。实验结果表明，人发标样GBW09101中铈的测定值与参考值吻合，证明本法准确可靠。

1.8 脑组织病理学检查

行为学实验结束后，每组随机取雌、雄SD大鼠各5只，腹主动脉取血后，断头取脑。脑组织固定于4%多聚甲醛溶液3～5 d。经脱水、透明、浸蜡及包埋处理后，连续冠状切面切取厚度为4μm的石蜡切片。展片、烘片和烤片后，HE染色，光学显微镜下对脑组织进行病理学检查。

1.9 统计学分析

应用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。对于Morris水迷宫、定位航向实验的指标采用双因素重复测量方差分析；其他各组指标，采用单因素方差分析，实验组与对照组间的两两比较采用Dunnett-t检验。统计学检验水平为α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠一般情况和染毒后脑组织中Ce元素的含量

硝酸铈染毒90 d大鼠体质量变化结果和脑组织中Ce元素的含量见表1。高剂量组500 mg/(kg·d)雄性大鼠与对照组相比，体质量出现明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。雌、雄大鼠各组血生化及血象指标未见明显异常(结果未显示)。与对照组相比，雌、雄SD大鼠硝酸铈染毒后脑组织中铈元素含量差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 硝酸铈染毒对大鼠体质量和脑组织中Ce元素含量的影响

2.2 旷场实验、高架十字迷宫实验和转棒实验结果

大鼠暴露硝酸铈90 d后，旷场实验结果显示，与对照组相比，低、中、高硝酸铈剂量组大鼠的水平运动距离、进入中央区次数和中央区停留时间的差异均无统计学意义(P＞0.05，表2)；高架十字迷宫结果显示，与对照组相比，各硝酸铈剂量组雌雄大鼠进入开臂时间百分比和进入开臂次数百分比差异均无统计学意义(P＞0.05，表3)。

表2 硝酸铈90 d暴露雌性大鼠旷场实验、高架十字迷宫实验和转棒实验结果(n=12)

表3 硝酸铈90 d暴露雄性大鼠旷场实验、高架十字迷宫实验和转棒实验结果(n=12)

2.3 Morris水迷宫实验结果

硝酸铈90 d暴露后雌雄SD大鼠定位航向实验结果如图1所示，随着训练天数增加，各组大鼠平台学习时间减少。但在训练4 d中，与对照组相比，各硝酸铈暴露组雌、雄大鼠的逃避期差异均无统计学意义(P＞0.05)。

图1 硝酸铈90 d暴露对大鼠定位航向的影响(n=12)

雌雄SD大鼠空间探索实验结果如表4和表5所示，各组雌雄大鼠游泳总距离、游泳速度、进入目标象限次数、目标象限游泳时间和穿越平台位置次数与对照组间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表4 硝酸铈90 d暴露雌性大鼠水迷宫实验结果(n=12)

表5 硝酸铈90 d暴露雄性大鼠水迷宫实验结果(n=12)

2.4 大鼠海马组织病理学检查结果

硝酸铈亚慢性暴露90 d对大鼠海马组织CA1区和DG区的影响如图2和图3所示。在光学显微镜下，与对照组相比，各硝酸铈剂量组雌雄大鼠海马组织CA1区神经元数量正常，呈圆形或椭圆形，核仁清晰，着色均匀；DG区颗粒细胞边界清晰，组织分界明显，神经元细胞形态完整，数量无明显差异，细胞核未见异常。此结果表明亚慢性硝酸铈暴露未显示对雌雄大鼠海马组织结构产生病理性改变。

图2 硝酸铈90 d暴露对大鼠海马组织CA1区的影响(×400)

图3 硝酸铈90 d暴露对大鼠海马组织DG区的影响(×400)

3 讨论

作为重要的战略资源，稀土需求量逐年增加[15]。铈在众稀土元素中丰度最高，由于其良好的生物活性和独特的理化性质，被应用于多个领域[16]。已有研究证明，镧、钐和钇能够透过血脑屏障，对动物的学习记忆能力产生损害作用[17-19]，围产期钆暴露能够导致子代小鼠焦虑样行为及运动障碍[20]。但对于铈元素对神经行为影响的报道尚不完善。主要存在以下不足：①既往关于神经毒性的研究以镧元素为主，对铈及其化合物相关性研究较少；②稀土元素神经毒性的资料集中于早期，而早期评价方法技术有限。本次研究从情绪、运动能力和学习记忆能力方面对铈元素进行评价，以期为制定铈元素健康指导值提供依据。

旷场实验和高架十字迷宫实验是基于啮齿动物回避开放或高架场所的天性和对新环境的探索而构建的动物症状模型，理论上，焦虑的动物具有趋触性，具体表现为重复无目的沿着旷场箱壁运动和较长时间停留在闭臂空间，作为温和、不刺激的实验方法，被广泛用于测试药物等因素对焦虑情绪的影响[21-22]。本研究结果显示在旷场实验和高架十字迷宫实验中，与对照组相比，硝酸铈暴露组雌雄大鼠进入中央区次数、中央区停留时间、开臂次数百分比和开臂时间百分比差异均无统计学意义，表明经口暴露硝酸稀土可能不会引起SD大鼠焦虑。旷场实验和转棒实验也用于评价硝酸铈长期暴露对大鼠运动能力的影响。两者分别用于评价动物自主活动能力和运动协调能力。研究发现，与对照组相比，雌雄大鼠各剂量组的水平运动距离和在棒时间差异均无统计学意义，但雌雄大鼠的水平运动距离相差较大，提示硝酸铈可能不会对大鼠的运动协调能力产生影响，但旷场实验评价动物自主活动能力可能存在性别差异，需要进一步确证及机制探索。

流行病学调查研究显示，与对照区儿童相比，稀土矿区儿童智商、注意力和学习记忆等认知能力明显降低，引发学术界对稀土元素神经毒性的广泛关注[23-24]。Morris水迷宫被广泛用来评估啮齿动物的学习记忆能力。既往研究主要以稀土元素镧为关注点。有研究表明，饮水给予Wistar大鼠氯化镧能够增加定位航行实验中的逃避潜伏期，降低大鼠穿过目标象限和原平台的次数，提示稀土元素镧会降低大鼠的学习记忆能力[25]，还发现经口灌胃ICR小鼠硝酸镧，低剂量时小鼠在水迷宫中的反应时间和错误次数缩短，提示镧元素具有低剂量兴奋效应[26]。已有相关研究发现铈能穿过小鼠血脑屏障，蓄积于小鼠海马中，小鼠经口暴露氯化铈60 d，剂量为20 mg/kg时，能够引起海马神经损伤及炎症反应，从而使学习记忆能力受损，暴露90 d时，氯化铈剂量低至1 mg/kg时，就观察到海马组织发生病理学损害[27-28]。但本研究行为学结果表明，与对照组相比，硝酸铈各剂量组大鼠4 d定位航行实验的逃避潜伏期差异无统计学意义。空间探索实验中，进入目标象限次数、目标象限游泳时间及穿越平台位置次数等指标与对照组相比，差异均无统计学意义。海马在调控焦虑行为和学习记忆能力中发挥重要作用[29-30]。本次实验对硝酸铈各剂量组大鼠海马组织切片HE染色后，也并未观察到中毒病理特征。ICP-MS检测结果显示，SD大鼠硝酸铈染毒后海马组织中铈元素的含量有一定的升高，但蓄积并不明显。且雌、雄对照组(ddH2O)大鼠海马组织中均有相对较高的稀土元素铈，该现象也在相关稀土研究中发现[31-33]，提示实验动物具有一定量的稀土元素本底值。这些结果提示硝酸铈长期经口暴露可能并不会对SD雌雄大鼠的学习记忆能力产生损害作用，其原因可能是血脑屏障对稀土元素有一定的阻碍作用[34]，使得只有少量铈元素蓄积在脑组织中。与已有小鼠研究结果的不一致，可能与物种差异有关，尚需进一步研究探讨。

本实验遵循OECD 424准则，从焦虑、运动协调平衡能力和学习记忆能力三方面评价硝酸铈亚慢性暴露对SD雌雄大鼠神经行为的影响，发现SD大鼠灌胃给予500 mg/(kg·d)硝酸铈并不会对其神经行为产生影响。Wu等[14]按300 mg/(kg·d)采用90 d经口暴露给予硝酸铈，发现雄性大鼠体质量明显降低，中高剂量组血生化和血象部分指标异常，建议硝酸铈的NOAEL值为75 mg/(kg·d)。但本研究结果说明在硝酸铈浓度为75 mg/(kg·d)时，硝酸铈经口暴露可能不会对大鼠神经行为功能产生影响，为稀土元素铈的健康指导值确定提供了进一步的科学依据。但动物行为模型本质上只是模拟神经系统疾病的特定症状，由于本次实验评估方法的局限性，因此硝酸铈对神经系统的影响与接触风险还需要结合分子实验进一步确认。