长链非编码RNA CASC9在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

梁 峰，张 玮，李 飞，王胜杰，杜宇晶，张迎春

(河北北方学院附属第一医院普通外科，河北 张家口 075000)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是中国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升和年轻化趋势[1]。尽管结直肠癌的诊断与治疗已经取得了显著进步，但其疗效及预后仍不容乐观[2]。因此，结直肠癌的早期诊疗依然是本领域的研究重点。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指长度大于200 nt的非编码RNA，广泛参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等多种生物学过程[3-4]。lncRNA在细胞周期、表观遗传、转录及转录后调控等生物学过程中发挥着重要作用，尤其是参与恶性肿瘤的发生发展过程[5-7]。癌症易感性候选基因9(cancer susceptibility candidate 9，CASC9)是具有致癌作用的lncRNA，在肝癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中高表达[8-9]。本课题组前期研究发现CASC9在结直肠癌细胞中表达升高，CASC9可作为miR-195-5p吸附海绵靶向调控细胞周期蛋白D1表达，从而促进结直肠癌细胞的增殖并抑制其凋亡[10]。然而，目前关于lncRNA CASC9在结直肠癌中的临床意义报道较少。因此，本研究拟收集结直肠癌患者癌组织和癌旁组织，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)法检测lncRNA CASC9的表达情况，探讨lncRNA CASC9在结直肠癌中的表达及其临床意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2013年7月—2017年1月于河北北方学院附属第一医院接受手术切除后液氮保存的87例新鲜冰冻结直肠癌组织及配对癌旁组织，同时获取临床资料。所有患者通过电话或门诊随访3年，随访截至2020年1月30日。87例结直肠癌患者中，男48例，女39例；年龄35～75岁，平均(57.46±12.63)岁；根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，其中Ⅰ期18例，Ⅱ期45例，Ⅲ期24例；根据世界卫生组织(WHO)病理分化标准，低分化33例，中分化41例，高分化13例。最终纳入研究的患者均经病理切片证实为结肠癌或直肠癌。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准为：①患者临床资料完整；②术前从未接受过介入、射频消融术、放化疗及免疫治疗；③经病理切片证实为结肠癌或直肠癌。排除标准为：①合并其他类型肿瘤；②术前曾接受过放、化疗或中医治疗；③肿瘤以外其他原因导致的患者死亡。

1.3 实时荧光定量PCR检测lnc RNA CASC9在结直肠癌及癌旁组织中的表达

使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA，超微量紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。每组样本取1 μg RNA，根据逆转录试剂盒[RNA PCR Kit(AMV)，TaKaRa]说明书，将RNA逆转录为cDNA，-20℃保存。以1μL cDNA为模板，按照qPCR试剂盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa)说明书，进行qPCR扩增。反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，PCR上、下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O 7.8μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，68℃延伸45 s，共40个循环。产物经琼脂电泳，以Labworks 4.5图像分析系统进行分析，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。引物序列如下：CASC9上游5′-TTGGTCAGCCACATTC ATGGT-3′，下 游5′-AGTGCCAATGACTCTCCAGC-3′；GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，符合正态分布且方差齐性的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制不同lncRNA CASC9表达水平患者组间的生存曲线，并应用Log-rank检验比较两组间生存率的差异，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 lnc RNA CASC9在结直肠癌及癌旁组织中的表达情况

qPCR检测结果显示，lncRNA CASC9在结直肠癌组织中的表达(6.395±0.164)较癌旁组织(2.387±0.098)明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图1。

图1 lncRNA CASC9在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 lncRNA CASC9与结直肠癌组织病理指标的关系

以lncRNA CASC9在87例结直肠癌组织中相对表达量的中位值(6.61)为界，将患者分为高lncRNA CASC9表达组(n=52)和低lncRNA CASC9表达组(n=35)，并分析其表达水平与结直肠癌患者临床病理指标的相关性。相关性分析结果显示，结直肠癌组织中lncRNA CASC9的表达水平与癌组织的不同分化程度(χ2=6.877，P=0.032)、TNM分期(χ2=7.660，P=0.022)、是否发生淋巴结转移(χ2=9.901，P=0.002)明显相关，而与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置无明显相关关系(均为P＞0.05，表1)。

表1 结直肠癌组织中lnc RNA CASC9的表达水平与病理指标的关系(n=87)

2.3 lncRNA CASC9在结直肠癌组织中的表达与患者术后生存率的关系

术后随访3年，根据随访资料，绘制lncRNA CASC9低表达组和高表达组的生存曲线并进行Logrank检验分析。结果显示，lncRNA CASC9高表达组患者的总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progression-free survival，PFS)均明显短于低表达组(χ2=17.91，P＜0.01；χ2=11.23，P=0.001)。见图2。

图2 lnc RNA CASC9表达与结直肠癌患者术后生存曲线的关系

3 讨论

越来越多的证据表明，lncRNA表达失调与肿瘤的发生、进展和预后不良有关，可作为肿瘤早期诊断的新型生物标志物[11]。值得注意的是，有研究发现lncRNA CASC9的表达与多种恶性肿瘤的发生与发展密切相关[12-14]。Yang等[15]研究表明lncRNA CASC9在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中显著高表达，且与患者肿瘤大小、临床分期、区域淋巴结转移和总生存期相关。Wu等[16]发现，食管鳞状细胞癌组织芯片显示lncRNA CASC9在该研究中lncRNA表达上调最多，且高表达lncRNA CASC9的患者预后较差；体内外研究表明lncRNA CASC9表达下调可显著抑制食管鳞状细胞癌细胞体外生长和裸鼠肿瘤发生。Zhan等[17]研究发现lncRNA CASC9在膀胱癌中的表达明显上调，并与组织学分级、TNM分期和预后有关。进一步研究发现lncRNA CASC9充当miR-497-5p分子海绵，上调卷曲同源物6(FZD6)表达，随后激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进膀胱癌的发生与发展。Zhao等[18]研究表明lncRNA CASC9在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调，并且lncRNA CASC9的表达水平也被证实是非小细胞肺癌独立的预后因素。上述研究表明，lncRNA CASC9影响肿瘤的发生和发展。

然而，关于lncRNA CASC9评价结直肠癌临床预后价值的相关研究却鲜有报道。因此，本研究着重探讨lncRNA CASC9的表达与结直肠癌患者临床病理指标以及预后之间的关系。本研究应用qPCR技术检测87例结直肠癌和相应癌旁组织中lncRNA CASC9的表达水平，结果显示lncRNA CASC9在结直肠癌组织较癌旁组织中呈明显高表达，且其表达水平高低与结直肠癌发展的多个临床因素密切相关。本研究进一步分析了不同病理指标结直肠癌组织中lncRNA CASC9的表达情况，结果发现分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴结转移者lncRNA CASC9阳性表达率越高，其中分化程度、TNM分期是肿瘤恶性生物学行为的表现，而淋巴结转移是结直肠癌患者预后不良的重要指标，提示lncRNA CASC9的异常高表达可能预示着结直肠癌患者预后不良。接下来，我们分析了lncRNA CASC9表达水平与结直肠癌患者预后的关系，结果显示，lncRNA CASC9高表达组患者的术后总生存期和无病生存期明显短于lncRNA CASC9低表达组。

综上所述，lncRNA CASC9在结直肠癌组织中的表达明显升高，与结直肠癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，其有可能成为判断结直肠癌患者预后的潜在生物标志物。本研究在今后也将扩大样本收集量，以进一步确认lncRNA CASC9表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系，并对相关机制进行深入研究。