N-乙酰半胱氨酸对纳米二氧化钛诱发细胞遗传损伤的保护作用

王 晗，周 滔，徐云东，郭锡汉，倪 娟，汪 旭，*

(1．云南师范大学生命科学学院，云南 昆明650500；2．云南师范大学生物能源持续开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

纳米二氧化钛(titanium dioxide nanoparticles，TiO2-NPs)在日常生活中应用广泛，其对人体的遗传毒性效应已成为公共卫生领域关注的热点[1]。已有研究表明，TiO2-NPs可在人体多器官尤其是肝脏和肺脏中大量累积[2]。离体情况下，TiO2-NPs可以通过诱导细胞产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)、消耗细胞中谷胱甘肽，引起细胞炎症导致细胞死亡[3-5]。部分动物实验表明，摄入过量的TiO2-NPs可激活肝、肺细胞中多种应激通路，引起细胞死亡，进而损伤肝、肺等器官[6-7]。

端粒(telomere)是稳固真核细胞染色体末端特殊且重要的结构，端粒长度(telomere length，TL)改变会影响染色体末端稳定和细胞增殖，诱发染色体不稳定(chromosome instability，CIN)，引起端粒功能紊乱，诱导细胞死亡甚至癌变[8]。本课题组前期研究发现，TiO2-NPs可诱导人正常肝L-02细胞大量ROS产生、TL缩短、CIN升高[9]。TiO2-NPs的遗传毒性可通过诱发TL改变，进而导致端粒功能障碍所致。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)表现出了较好的纳米颗粒遗传毒性抑制效应[10]。那么，TiO2-NPs诱导的正常细胞TL改变等遗传损伤效应，是否可以被抗氧化剂NAC抑制，成为本研究探究的重点。因此，本文拟在人肝细胞L-02及肺细胞HBE中，采用TiO2-NPs单独暴露及其与NAC联合暴露，检测两种细胞TL、CIN及细胞死亡率的改变情况，为研究NAC在抑制TiO2-NPs诱发遗传毒性中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株培养及分组处理

人正常肝细胞L-02(中国科学院上海细胞库)和人正常肺上皮细胞HBE(中国科学院昆明细胞库)分别培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中。实验用TiO2-NPs(Sigma，德国)及NAC(索莱宝，北京)均用超纯水配制。为确保TiO2-NPs分散液均匀，每次使用前均需要将分散液置于超声波清洗仪(220 V，500 W)分散处理20 min。

分别取对数生长期的L-02、HBE细胞以3×105个/mL的浓度接种到6孔板中继续培养，待细胞贴壁后，将细胞分为3组，对照组(正常培养条件，无TiO2-NPs和NAC)，TiO2-NPs(80μg/mL)暴露组、TiO2-NPs(80μg/mL)与NAC(20μmol/L)联合暴露组，各组细胞培养72 h后进行检测。

1.2 过氧化氢检测

过氧化氢(H2O2)是ROS的主要成分之一，检测H2O2浓度可在一定程度上反映细胞内ROS的生成量。利用过氧化氢检测试剂盒(碧云天，上海)收集各组细胞进行裂解，取上清液，用酶标仪测定D(560)，依据H2O2标准曲线计算细胞中H2O2浓度。

1.3 端粒长度测量

利用DNA提取试剂盒(天根，北京)分别提取各组细胞总DNA，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)进行端粒绝对长度测量，测量基因组拷贝数的单拷贝基因选用36B4。PCR所需引物、标准品序列及测量及计算方法参考文献[11]。

1.4 胞质分裂阻断微核细胞组分析

分别收集各组细胞，加入终浓度为4.5μg/mL的细胞松弛素B培养细胞28 h，进行细胞涂片；在光学显微镜下计数凋亡、坏死细胞，计算细胞凋亡率及细胞坏死率；以胞质分裂阻断微核细胞组试验(cytokinesis-block micronucleus cytome assay，CBMNCyt)分析染色体不稳定指标，即计数至少1 000个双核细胞(binucleated cell，BNC)中微核(micronuclei，MN)、核质桥(nucleoplasmic bridges，NPB)及核芽(nuclear bud，NBud)的数量，并计算发生频率(‰)，三者频率相加得到细胞的总CIN频率，方法和指标判别参考文献[12]。

1.5 统计分析

应用SPSS 17.0软件，采用单因素方差分析和独立样本t检验对数据进行分析，P＜0.05为差异具有统计学意义，使用软件GraphPad Prism 5.0作图。

2 结果

2.1 NAC与TiO2-NPs暴露对L-02、HBE细胞内H2O2浓度的影响

H2O2浓度检测结果显示，与对照组相比，TiO2-NPs暴露72 h，可显著诱导L-02、HBE细胞内H2O2浓度升高(L-02细胞，P＜0.01；HBE细胞，P=0.04)，当TiO2-NPs联合NAC暴露72 h后，L-02和HBE细胞内的H2O2浓度仍较对照组显著升高(L-02细胞，P=0.003；HBE细胞，P=0.006)，而与TiO2-NPs单独暴露组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

2.2 NAC对TiO2-NPs暴露后L-02和HBE细胞端粒长度的稳定作用

对端粒长度进行测量后发现，与对照组相比，TiO2-NPs暴露72 h后可诱导L-02和HBE细胞TL缩短(均为P＜0.01)；而当TiO2-NPs和NAC共同培养72 h后L-02和HBE细胞的TL与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，并且联合暴露下的两种受试细胞TL显著长于TiO2-NPs单独暴露组(均为P＜0.01)，见图2。提示NAC可维持TiO2-NPs暴露下的TL稳定。

图2 TiO2-NPs与NAC暴露72 h后L-02和HBE细胞端粒长度的变化

2.3 NAC对TiO2-NPs暴露后L-02和HBE细胞染色体稳定性的促进作用

在肝正常L-02细胞和肺正常HBE细胞中，与对照组比较，TiO2-NPs暴露均可显著增加细胞的CIN(均为P＜0.01)；当NAC与TiO2-NPs联合暴露时，L-02和HBE细胞的CIN较各自对照组亦显著升高(L-02细胞，P=0.025；HBE细胞，P=0.008)。与TiO2-NPs单独暴露组相比，NAC和TiO2-NPs联合暴露组两种细胞的CIN均显著降低(L-02细胞，P=0.002；HBE细胞，P=0.03)，见图3。

图3 TiO2-NPs与NAC暴露72 h后L-02和HBE细胞染色体不稳定性的改变

2.4 NAC对TiO2-NPs暴露导致的L-02和HBE细胞死亡的抑制作用

正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞经吉姆萨染色制片后，在形态学上均有显著差异。正常细胞如图4A所示，形态学上凋亡细胞有完整的细胞膜，染色质聚集，细胞着色比正常细胞深，细胞核边界清晰或核分解成核小体，包裹在完整的胞浆或胞膜内，并形成大小不一且染色更深的凋亡小体(图4B)；坏死的细胞在形态学上表现为细胞膨胀、细胞膜不完整或直接不存在、细胞核呈无规则状且染色较浅(图4C)。进一步统计分析TiO2-NPs和NAC对受试细胞死亡方式的影响时，研究结果显示，TiO2-NPs暴露72 h后L-02和HBE细胞死亡(凋亡和坏死细胞总和)率均较对照组显著增加(L-02细胞，P＜0.01；HBE细胞，P=0.012)，并以细胞坏死方式为主；而NAC与TiO2-NPs联合暴露后细胞死亡率较TiO2-NPs单独暴露组显著降低(L-02细胞，P=0.004；HBE细胞，P=0.007)，且联合暴露组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05，图4D、F)。值得一提的是，在比较细胞死亡方式时发现，与TiO2-NPs单独暴露相比，L-02细胞和HBE细胞中，TiO2-NPs和NAC联合暴露组的细胞坏死率均有所减少(图4E、G)。

图4 TiO2-NPs与NAC暴露72 h后L-02和HBE细胞死亡情况

3 讨论

TiO2-NPs因其良好的着色性以及独特理化性质，已广泛应用在化妆品、食品加工等领域[12-13]，普遍认为，TiO2-NPs通过诱导细胞产生大量ROS诱发细胞氧化胁迫，可诱导体外培养细胞微核率升高等效应，表现出遗传毒性[3-5，14-17]，抗氧化剂对其产生的遗传毒性具有一定抑制作用[18-19]。端粒作为维护染色体稳定性的染色体末端结构，与细胞衰老、基因组不稳定性密切相关。当细胞TL改变，将诱导细胞衰老、死亡异常，甚至产生癌变[20]。

本研究首先将人正常肝细胞L-02和肺细胞HBE单独暴露于TiO2-NPs中，发现TiO2-NPs显著诱导受试细胞内H2O2浓度升高，同时TiO2-NPs暴露后，两株受试细胞均表现出TL缩短、CIN率升高以及坏死率上升。本研究提示TiO2-NPs可诱导细胞产生大量ROS，进而引起细胞氧化胁迫。正是因为端粒作为胞内氧化损伤的敏感位点，易被ROS攻击[21]，因此在TiO2-NPs暴露下受试细胞TL缩短、CIN升高，诱发端粒紊乱，产生遗传损伤。

在已确定本研究体系中TiO2-NPs可诱发受试细胞端粒长度缩短等遗传损伤的情况下，本研究引入抗氧化剂NAC。当TiO2-NPs与NAC联合暴露后，结果发现，NAC的加入能有效减缓TiO2-NPs暴露后两种受试细胞表现出的TL缩短、CIN率及细胞坏死率升高，尤其是在NAC与TiO2-NPs共暴露下，两种受试细胞的TL和细胞死亡率与对照组间的差异均无统计学意义，说明NAC展现了良好的拮抗TiO2-NPs遗传损伤作用。

NAC是一种在国内外许多研究中得到证实的抗氧化物质[18，22-23]，已有研究发现，NAC预处理可明显降低纳米颗粒对离体细胞造成的氧化损伤[9]。同时在体内环境下NAC同样可抑制TiO2-NPs的毒性作用。Elnagar等[24]证实，喂饲NAC可对TiO2-NPs造成的大鼠睾丸损伤起到一定保护作用，并能改善TiO2-NPs引发的DNA损伤。Smallcombe等[25]同样发现NAC预处理可减少TiO2-NPs引起的小鼠呼吸道损伤。本文结果也提示，体外培养条件下，抗氧化剂NAC可以有效抑制或减缓TiO2-NPs在人正常肝细胞L-02及人正常肺上皮细胞HBE中引发的TL异常，降低遗传毒性发生。

因TiO2-NPs最显著的毒性效应机制是造成细胞氧化胁迫，进一步诱导细胞产生氧化损伤，在本实验中，TiO2-NPs暴露引起了受试细胞内ROS组分之一的H2O2浓度的显著升高。然而，研究结果显示，TiO2-NPs与NAC联合暴露并未明显降低因TiO2-NPs暴露所升高的胞内H2O2浓度，一方面可能源于本研究使用的NAC剂量(20μmol/L)及处理时间(72 h)还不足以完全抵抗高剂量TiO2-NPs(80μg/mL)诱导产生的以H2O2为代表的ROS水平，推测NAC对TiO2-NPs诱导的细胞内ROS产生的抑制作用可能依赖于抗氧化剂浓度或处理时间；另一方面，作为抗氧化剂，NAC在未降低胞内ROS水平的情况下，已经发挥了减缓受试细胞遗传损伤的效应，NAC究竟通过何种分子机制，在不改变ROS水平前提下有效抑制TiO2-NPs诱导端粒功能紊乱，有待进一步研究。

综上，本研究选用两种人组织来源的正常细胞，发现TiO2-NPs在人正常肝细胞L-02及人正常肺上皮细胞HBE中暴露72 h后可以导致细胞内ROS过量产生并引起细胞端粒功能紊乱；而抗氧化剂NAC可有效抑制TiO2-NPs暴露下诱发的端粒功能紊乱，促进细胞的染色体稳定，阻止细胞死亡。本研究提示，在日常生活中，在避免不了纳米颗粒暴露的情况下，补充一定剂量的抗氧化剂如NAC等，可能会降低纳米颗粒暴露引起的细胞端粒功能紊乱等遗传毒性。