MicroRNA-590和microRNA-196b在儿童IgA肾病诊断中的价值

沈银红，沈红

（青海省妇女儿童医院 肾病科，青海 西宁810007）

IgA 肾病是肾小球系膜区以IgA 或IgA 沉积为主，伴或不伴有其他免疫蛋白在肾小球系膜区沉积的原发性肾小球疾病，包括局灶节段性病变、毛细血管内增生病变等。临床表现为反复发作性血尿，伴有不同程度的尿蛋白，部分患儿可出现肾功能不全，易发展为终末期肾病，严重危害患儿生命健康[1-3]。临床主要通过肾活检病理诊断，光镜下常见弥漫性系膜细胞增生或局灶阶段增生性肾小球肾炎，但肾活检术属创伤性技术，儿童接受度差，且少数患儿有肾活检并发症需手术止血或肾切除[4]，因此有必要寻求IgA 肾病的无创性检查的生物学标志物。研究[5-6]认为，IgA 肾病的发生与免疫功能低下及氧化应激损伤密切相关。microRNA 在免疫学中的研究日益增多，研究表明，microRNA-590（miR-590）异常低表达可诱发口舌鳞癌中细胞的免疫逃逸[7]。miR-590 可有效减轻急性肾损伤小鼠肾损伤程度[8]， microRNA-196b（miR-196b） 也参与小鼠肾脏氧化应激损伤[9]。miR-590 和miR-196b 在IgA 肾病中的研究较少，因此本研究重点探讨miR-590、miR-196b 在IgA 肾病中的表达及作用，为临床IgA 肾病检查提供新的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月—2019年5月青海省妇女儿童医院经肾活检病理诊断为原发性IgA 肾病患儿83 例。其中，男性42 例，女性41 例；年龄3～16 岁，平均（8.52±1.23）岁；病程1 个月～1.5年，平均（0.72±0.16）年。纳入标准：符合IgA 肾病诊断标准[10]；肾活检前3 个月未进行糖皮质激素及（或）免疫抑制剂治疗。排除标准：合并系统性红斑狼疮、过敏性紫癜、血液病等系统性疾病引起的继发性IgA 肾病；肾活检光镜下肾小球数目＜8；eGFR＜10 mL/（min·1.73 m2）。选取非IgA 肾病患儿35 例，包括肾微小病变5 例、局灶节段性肾小球肾炎8 例、膜性肾病15 例、局灶节段性肾小球硬化症7 例。其中，男性19 例，女性16 例；年龄3～16 岁，平均（8.47±1.45）岁。另选取同期该院体检健康儿童42例作为对照组。其中，男性18 例，女性24 例；年龄3～16 岁，平均（8.95±1.35）岁。3 组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有受试者均采集肘静脉血2 mL，3 000 r/min，20 min 离心，取上清液，置入-20℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.2 临床指标 受试者年龄、性别、24 h 蛋白尿、血清白蛋白、血肌酐（Scr）。患儿血清IgA 水平采用免疫比浊法检测。

1.2.3 病理分级 根据Lee 氏分级[11]分为Ⅰ级7 例，Ⅱ级8 例，Ⅲ级25 例，Ⅳ级16 例，Ⅴ级27 例。Ⅰ级：肾小球绝大多数正常，偶见轻度系膜增宽，伴和（或）不伴细胞增生，肾小管和肾间质无改变。Ⅱ级：肾小球有局灶系膜增殖和硬化（＜50%），有小新月体，肾小管和肾间质无损害。Ⅲ级：肾小球呈弥漫性系膜增值和增宽（偶尔局灶节段），偶见小新月体；肾小管和肾间质改变则呈现出局灶性肾间质水肿，偶见细胞浸润，罕见肾小管萎缩；Ⅳ级：肾小球病变呈重度弥漫性系膜增生和硬化，部分或全部肾小球硬化，可见新月体（＜45%）。肾小管萎缩，肾间质浸润，偶见肾间质泡沫细胞；V级：肾小球新月体形成＞45%；肾小管和肾间质病变类似于Ⅳ级，但较Ⅳ级严重。

1.2.4 qRT-PCR 法检测血清miR-590、miR-196b相对表达量 按照Trizol 试剂盒操作说明书提取血清总RNA，按照逆转录试剂盒操作步骤将2 μg RNA 逆转录为cDNA，按照SYBR Green RCR Master Mix 试剂说明书配制反应体系并加样。完成后将其放入荧光定量PCR 仪上进行反应，反应条件为：95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，共40 个循环。miR-590、miR-196b 以U6为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。反应结束后收集数据，采用2-ΔΔCt算法计算miR-590、miR-196b 相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料的比较

3 组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3组肌酐、白蛋白、24 h蛋白尿、血清IgA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），IgA肾病组肌酐、24 h蛋白尿、血清IgA水平较对照组、非IgA肾病组升高（P＜0.05），IgA肾病组白蛋白水平较对照组、非IgA肾病组下降（P＜0.05）。见表2。

表2 3组一般资料比较

2.2 3 组受试者血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相对表达量的比较

3 组miR-590 mRNA、miR-196b mRNA 相 对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），IgA 肾病组miR-590 mRNA 相对表达量较对照组、非IgA 肾病组下降（P＜0.05），IgA 肾病组miR-196b mRNA 相对表达量较对照组、非IgA 肾病组升高（P＜0.05）。见表3。

表3 3组受试者血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相对表达量比较

2.3 不同程度IgA 肾病患儿血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相对表达量比较

不同程度IgA肾病患儿miR-590 mRNA、miR-196b mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），IgA 肾病组患儿miR-590 表达水平随病情加重依次下降（P＜0.05），miR-196b 表达水平随病情加重依次升高（P＜0.05）。见表4。

表4 不同程度IgA肾病患儿血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相对表达量的比较

2.4 miR-590、miR-196b 单独及两者联合对IgA肾病的诊断作用

miR-590 对IgA 肾病诊断 的AUC 为0.873（95% CI：0.809，0.920），最佳截断值为0.737，敏感性为84.1%（95% CI：0.748，0.910）、特异性为82.6%（95% CI：0.716，0.907）；miR-196b 对IgA 肾病诊断的AUC 为0.785（95% CI：0.713，0.847），最佳截断值为1.927，敏感性为90.7%（95% CI：0.838，0.945）、特异性为64.8%（95% CI：0.513，0.750）；两者联合检测对IgA 肾病诊断的AUC 为0.914（95% CI：0.858，0.952），敏感性为88.6%（95% CI：0.801，0.944）、特异性为87.0%（95%CI：0.767，0.939）。见图1。

图1 miR-590、miR-196b及两者联合检测对IgA肾病诊断的ROC曲线

3 讨论

研究[12]表明，糖基化异常的IgA 分子与抗聚糖IgG 自身抗体结合形成免疫复合物在血液循环中逃脱正常清除机制，在肾小球系膜区沉积，诱导炎症反应与系膜细胞的增殖导致肾小球损伤，是造成IgA 肾病的原因之一。林佳如等[13]研究表明，Th17 细胞免疫失衡在调控IgA 糖基化过程中发挥重要作用。研究[7]显示，miR-590 mimics 可增强免疫效应细胞的生存率，阻断舌癌的免疫逃逸，进而减少免疫活性细胞凋亡。ZHOU 等[14]研究表明，miR-590 通过控制IL-2 表达对T 细胞免疫应答，抑制结直肠癌血管生成和转移。BROGAARD 等[15]研究显示，miR-590 是猪对甲型H1N2 流感肺部免疫应答的重要调节因子。研究[8]显示，miR-590 可抑制脓毒症小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6 表达从而减轻小鼠急性肾损伤程度。miR-590 通过靶向tob1 促进致病性th17 细胞分化，与多发性肝硬化有关[16]。以上研究均显示，miR-590 可能与机体免疫活性密切相关。本研究IgA 肾病患儿血清miR-590 mRNA 相对表达量低于非IgA 肾病患儿及健康儿童，且随IgA 肾病患儿病情加重而依次降低，提示miR-590 与IgA 肾病的发病、发展可能有一定联系，猜测可能通过影响免疫系统平衡参与IgA 肾病发生，具体机制有待进一步研究。本研究ROC 结果显示，血清miR-590 水平对诊断IgA 肾病的曲线下面积为0.873，特异性和敏感性均在80%左右，提示miR-590 可能作为诊断IgA 肾病的生物学指标，截断值为0.737，表明miR-590 水平低于0.737 者发生IgA 肾病的风险高，为基础研究者和临床诊治者进行IgA 肾病研究及治疗提供了miRNA 靶点。

研究表明，异常糖基化IgA 不足以致病，机体在氧化应激过程中产生大量活性氧，ROS 堆积导致抗氧化防御系统遭到破坏，脂质过氧化物造成细胞膜转运功能障碍，酶活力、亚细胞器功能改变，自由基可经离子通道进入细胞内破坏细胞器成份，造成组织细胞损伤导致IgA 肾病的发生[17]。miR-196b 是miR-196 家族成员之一，位于人7p15.2 的进化高度保守区域[18]。孟娇等[19]从IgA肾病患者活检标本绘制出miRNA 表达图谱，发现IgA 肾病患者中miR-196b等65 种miRNA 分子表达下调，且降低程度与病情严重程度密切相关，提示miR-196b 在早期IgA 肾病的病理发展过程中发挥重要作用。本研究IgA 肾病患儿血清miR-196b 表达水平高于非IgA 肾病患儿及健康儿童，提示miR-196b 与IgA 肾病的发生、发展密切相关。李慧聪等[20]研究表明，miR-196 高表达通过抑制二硫化物异构酶A3 表达，进而抗氧化应激能力减弱参与小鼠肾脏损伤。猜测miR-196 可能通过氧化应激损伤途径参与IgA 肾病的发生。进一步研究显示，血清miR-196b 水平诊断IgA 肾病发病的曲线下面积为0.785，敏感性高，但特异性为64.8%，提示miR-196b 仅能作为辅助指标判别患儿是否发生IgA 肾病。本研究发现miR-590、miR-196b两者联合检测诊断IgA 肾病曲线下面积、敏感性、特异性大或高于miR-590、miR-196b 对IgA 肾病的诊断效果。提示联合检测效果优于单一检测，可能作为临床诊断IgA 肾病的辅助检测指标，有利于先筛查出高危IgA 肾病患儿，再进一步进行肾活检，从而优化疑似IgA 肾病的诊断流程。

综上所述，IgA 肾病患儿血清miR-590 低表达、血清miR-196b 高表达，两者联合检测对IgA 肾病具有较高诊断价值。但本研究存在一定不足，由于样本量较少，可能对本结果造成一定偏倚，此外对于miR-590、miR-196b 参与IgA 肾病的发病机制有待进一步研究。