MNV感染对乙肝疫苗效价评价的影响*

李晓波 王淑菁 付 瑞 王莎莎 秦 骁 李 威 黄宗文 贺争鸣 王 吉 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 102629)

实验动物是生命科学研究的基础，广泛应用于生物、医药、化工、农业、畜牧等领域，实验动物质量会直接影响到科学实验结果的可靠性和准确性，关系着产品质量和人民群众的身体健康。生物制品质量问题牵扯着人民大众的神经，是关系国计民生的大事，关乎国家的长治久安，而生物制品质量评价需要大量的动物实验，因此必须重视实验动物的质量问题，实验动物微生物的预防与控制就显得尤为紧迫和重要。

小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)是目前实验小鼠中感染率最高的病毒[1-2]，国际上一些知名的实验动物监管和检测机构如欧洲实验动物联合会(FELASA)[3]、Charles River实验室等已将其列为实验小鼠的常规检测项目，尽管我国已出台了MNV的团体标准，但不具有强制性，而实验动物国家标准目前还未要求实验小鼠排除MNV，因此我国大多数的实验动物生产和使用单位都未对其进行控制，因此，造成很多实验使用的小鼠是MNV阳性鼠。

已有报道MNV对巨噬细胞和树突状细胞具有感染亲嗜性，并能够感染B细胞[4-5]，感染免疫细胞的特性表明MNV可能会对免疫相关的实验造成影响。小鼠可通过发挥固有免疫及适应性免疫功能抗MNV感染，根据李晓波[6]研究表明MNV感染会影响小鼠的免疫应答，导致T细胞、B细胞含量及细胞因子含量发生显著改变。因此，MNV的感染极有可能会影响生物制品的质量评价，而目前这方面的研究尚处于空白。

乙肝疫苗为国家计划内疫苗(一类疫苗)，其质量把控至关重要，乙肝疫苗的检验依据《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版第三部进行，其中规定用NIH或BALB/c小鼠来测定重组乙肝疫苗(CHO细胞)的效价，本研究参照《中国药典》乙肝疫苗效价测定方法，选用BALB/c小鼠为实验对象，研究MNV的感染对乙肝疫苗效价测定的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1病毒株:小鼠诺如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，本实验室分离并保存[7]，TCID50为10-5.330/0.1 mL。

1.1.2实验动物:SPF级BALB/c小鼠，体质量8～10 g，雌性，共120只，购自国家啮齿类实验动物种子中心，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2017-0005，经检测符合SPF等级实验动物国家标准且MNV为阴性。动物实验于中国食品药品检定研究院屏障动物设施进行，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2017-0013，实验所用鼠料、水、垫料等均经灭菌处理，已通过中检院实验动物福利伦理审查委员会审查，中检动(福)第2018(B)020号，按实验动物的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂和仪器

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞，规格：20 μg/支，批号：201707YB06)为华北制药金坦生物技术股份有限公司生产；乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒(规格：96人份，批号：201709181)购自上海科华生物工程股份有限公司。酶标仪(Thermo，型号MK3)。

1.3 方法

1.3.1动物分组：动物随机分为感染组和对照组，每组60只，感染组经口灌胃0.2 mL MNV病毒液，对照组灌胃0.2 mL生理盐水。

1.3.2乙肝疫苗的免疫：小鼠感染MNV后第7天免疫乙肝疫苗，感染组和对照组均分为乙肝疫苗高剂量组(1.25 μg/mL)、中剂量组(0.31 μg/mL)和低剂量组(0.078 μg/mL)，每组20只，每只腹腔注射乙肝疫苗1 mL。于免疫后第7、14、21、28及35天分别经眼周静脉采血，分离血清。

1.3.3乙肝表面抗体(HbsAb)的检测：用乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒定性检测HbsAb，按说明书操作进行，每份样本测两次。

1.3.4结果的计算与分析：①计算半数动物有效剂量(ED50)：分别计算感染组和对照组各免疫时间点的ED50值，具体为统计各剂量组乙肝疫苗免疫后HbsAb阴阳性动物数量，计算距离比例=高于50%阳转率-50/高于50%阳转率- 低于50%阳转率，计算50%阳转终点对数=高于50%阳转率稀释对数+距离比例×稀释对数的因数，计算稀释度=1050%阳转终点对数，计算ED50=原浓度(20 μg/ml)/稀释度；②统计分析：采用SPSS19.0软件进行分析，t检验比较对照组与感染组总体ED50均值；卡方检验比较对照组与感染组总体HbsAb结果及各时间点、各剂量组的HbsAb结果，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ED50比较

由于免疫第7天HbsAb阳转率较低，无法计算其ED50。比较对照组和感染组各时间点ED50的总体均值，结果无统计学差异(P>0.05)；对比两组各时间点的ED50值可见，除了免疫后第21天两组的值接近，其余3个时间点感染组的ED50值均高于对照组(表1)。

表1 对照组及感染组ED50值比较(μg/mL)

2.2 HbsAb阳性率比较

2.2.1总体阳性率比较:对照组与感染组各免疫时间点HbsAb总体阴阳性结果见表2，经卡方检验，两组HbsAb阳性率无统计学差异(P>0.05)。

表2 对照组及感染组总体HbsAb结果比较

2.2.2各时间点两组HbsAb阳性率比较：分别比较免疫后各时间点两组之间HbsAb阳性率，经卡方检验，免疫乙肝疫苗后第7、14、21、28、35天感染组和对照组HbsAb阳性率均无统计学差异(P>0.05，表3)。

表3 不同时间点对照组及感染组HbsAb结果比较

2.2.3不同剂量组两组小鼠HbsAb阳性率比较:由于低剂量组HbsAb结果均为阴性，未对其进行统计学比较。经卡方检验，乙肝疫苗免疫后第28天及第35天，对照组小鼠免疫高剂量乙肝疫苗产生HbsAb的动物数量显著高于感染组(MNV阳性组)(P<0.05)；疫苗免疫后第14天，对照组小鼠免疫中剂量乙肝疫苗产生HbsAb的动物数量相比感染组(MNV阳性组)有显著提高(P<0.05)，其余各时间点未见统计学差异(表4)。

表4 各免疫剂量组内对照组及感染组HbsAb比较

3 讨论

《中国药典》2015年版第三部规定乙肝疫苗接种4～6周后采血，测定乙肝表面抗体，本实验选择在乙肝疫苗接种后第1～5周共5个时间点采血，对每个时间点的免疫效果分别进行比较，以更全面的评估MNV感染对乙肝疫苗效价测定的影响。实验的设计遵循实验动物福利的3R原则，使用尽量少的动物得到所需要的数据，每个剂量免疫20只，对小鼠进行少量多次采血，每次采血控制在小鼠循环血量的10%以内，大约100～200 μL，对动物的损伤较轻，并且保证了结果的准确性。对结果进行“定量”和“定性”的比较，“定量”指比较ED50，“定性”比较HbsAb的阴阳性结果。

从已有研究来看，目前还未有MNV的不同感染剂量会影响实验结果的报道。参考文献报道的方法[8-9]，本研究采用经口灌胃的方式和单一的攻毒剂量感染小鼠，但病毒的感染剂量仍是影响实验结果不可忽视的因素，针对MNV的不同感染剂量对乙肝疫苗质量评价结果影响的问题，还需后续的实验进行深入研究。按照《中国药典》2015年版第三部中规定的乙肝疫苗效价测定方法，需将乙肝疫苗浓度设为高、中、低3个剂量组来免疫小鼠，再根据每个剂量组的免疫结果来计算疫苗的半数动物有效剂量(ED50)。本研究在实验的每个时间节点均通过采集粪便的方式对小鼠的MNV进行监测，结果显示整个实验周期感染组小鼠MNV均为阳性，对照组均为阴性，确保了实验结果的准确性。

MNV感染对生物制品检定的影响，目前国内外均无相关的报道。尽管比较对照组和感染组所有时间点ED50的总体均值、两组HbsAb的总体阳性率及每个时间点HbsAb的阳性率，均未发现存在显著差异，但进一步比较各剂量组的结果，发现在免疫第14天，中剂量乙肝疫苗免疫对照组小鼠产生HbsAb的动物数量显著高于感染组；免疫第28天及第35天，高剂量疫苗免疫对照组小鼠产生HbsAb的动物数量均显著高于感染组。各时间点的ED50值相比，除了免疫第21天，其余时间点的ED50值对照组均低于感染组。药典规定的采血时间点是免疫后第28天～第42天，而实验结果表明这段时间两组的结果会出现差异。以上结果表明使用MNV感染的小鼠来评价乙肝疫苗会导致实验结果出现偏差，所测的乙肝疫苗效价有可能低于MNV阴性小鼠。

MNV对巨噬细胞和树突状细胞具有感染亲嗜性[4-5]，而巨噬细胞和树突状细胞在动物机体的免疫应答过程发挥着十分重要的作用，树突状细胞负责抗原递呈和加工，可促进T细胞活化，还可诱导T细胞产生B细胞刺激因子，促使B细胞分泌免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)，从而参与B细胞的生长、分化与抗体产生[10-11]。推测MNV感染导致乙肝疫苗效价测定值偏低主要有以下两点原因：一是病理方面因素：乙肝疫苗效价测定使用的是BALB/c小鼠，病理研究发现BALB/c小鼠脾发生的病理变化主要表现为脾小结数量的减少[12]，脾小结位于脾白髓中央动脉周围淋巴鞘的旁侧，为B细胞区，脾小结数量减少意味着淋巴细胞数量的减少，动物免疫力的降低；另一个原因是MNV感染造成的小鼠免疫功能的改变，辅助性T细胞分为Th1和Th2细胞，两种细胞之间通过分泌细胞因子，彼此交叉调节又互相抑制。我们先前报道的免疫指标变化研究中，MNV感染导致BALB/c小鼠γ干扰素(IFN-γ)含量显著升高[6]，而IFN-γ作为Th1的效应分子，具有辅助细胞免疫的作用，同时其高表达对Th2细胞的增殖分化又产生了抑制，而Th2细胞起辅助体液免疫的作用，因此间接影响到了小鼠的体液免疫应答。根据以上两点原因推测MNV感染影响了小鼠的体液免疫应答，进而影响到乙肝疫苗效价测定的结果。

本研究在MNV感染第7天进行免疫，属于感染的急性期，慢性期免疫(感染30 d后)是否同样会对乙肝疫苗效价的测定产生影响？先进行乙肝疫苗的免疫再感染MNV，以及免疫后的不同时间感染会产生什么影响？要进一步深入了解MNV感染对乙肝疫苗的影响，这些问题都有待后续进行深入研究。

致谢：感谢中检院肝炎室邱少辉等同事提供的帮助！