遗传性脐疝大鼠生物学特性的初步研究*

孙天奇 秦佟童 张 睿 陈菁青 唐玉玲 任延玲 邱业峰

(军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京 100071)

脐疝(umbilical hernia，UH)指腹腔内容物通过脐部薄弱区域突出体外，是常见的腹壁疝之一。临床上UH的手术治疗数量每年达10万～17.5万例[1-2]，是第二大常见的疝气类型[3]，严重影响人类健康和生活质量。在养殖行业中，猪、牛等畜牧动物的繁殖生产和育种工作也受到UH的影响：以在全球肉类供应中占有重要地位的猪为例，UH发病率为0.4%～1.2%[4]，其中规模化猪场中发病率最高可达5%[5]，且具有明显的遗传特性。UH是大多数哺乳动物共有的特征性结构，所以在野生动物[6]、宠物[7]及实验动物[8]中也均有发生。UH是一种多基因隐性遗传[9]的复杂性疾病，由于缺少稳定自发UH的临床样本或动物模型，目前其致病机制和易感基因尚处于探索阶段。

UH大鼠是本单位于2009年开始培育的一种自发UH且性状能够稳定遗传的大鼠种群，该种群从F12代起UH发病率即可达到100%[10]。本研究在该基础上继续采用全同胞交配法对自发性UH大鼠模型进行近交繁育至F32代，对F32代个体的表型特征、生长曲线、生化及血液指标、主要脏器系数等生物学特性进行了研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级UH大鼠为本中心生产繁育，实验动物生产许可证号：SCXK(军)2017-0014。SPF级SD大鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。本实验已通过军事科学院军事医学研究院福利伦理审查，审查编号：IACUC-DWZX-2020-060。

1.2 饲养及管理条件

大鼠饲养于本中心屏障环境动物实验室中，实验动物使用许可证号：SYXK(军)2017-0022。垫料为玉米芯，经高压灭菌处理，每周更换1次；饲料为本中心生产全价营养颗粒饲料，生产许可证号：SCXK(军)2017-0015；饮水为微电解无菌水温度：22～26 ℃，相对温度40%～60%，明暗交替12 h/12 h。

1.3 表型特征观察

分别取雌、雄性UH大鼠各12只，8～10周龄，观察UH发病部位外观特征。抓取大鼠呈直立状，用游标卡尺分别测量UH疝囊长轴、短轴长度，并进行分析。

1.4 脐部及周围组织病理切片制作和观察

分别取成年UH大鼠及SD大鼠各6只，CO2法处死动物，沿腹中线剪开腹部皮肤，暴露腹壁肌肉层，观察脐孔及脐环形态特征。以脐部为中心，剪取3 cm×3 cm腹壁肌肉，4%多聚甲醛固定。制作病理切片并进行苏木素-伊红(HE)染色，镜下观察脐部病理变化，具体步骤包括如下两步。

1.4.1切片制作:梯度乙醇脱水70%、80%、95%和100%各30 min，二甲苯两瓶各20 min，石蜡浸蜡两缸各12 min，石蜡包埋，切片厚度4 μm，烤片。

1.4.2HE染色:常归染色，中性树脂胶封固；光镜观察并显微照相。

1.5 生长曲线测定

分别取UH大鼠和SD大鼠各20只，雌雄各半，仔鼠自出生起至第8周，每周测量3次体质量，观察其生长发育情况，绘制生长曲线。

1.6 血常规及血液生化指标测定

分别取UH大鼠24只、SD大鼠18只，雌雄各半，8～10周龄。剪尾取血共1.5 mL，其中EDTA抗凝管盛装0.5 mL，用于血常规指标检测；离心管盛装1 mL，4 000 r/min离心5 min，取上层血清，用于测定血液生化指标。

1.7 主要脏器系数测定

分别取UH大鼠和SD大鼠，各20只，雌雄各半，8～10周龄。称体质量后，CO2法处死动物，按照腹腔至胸腔的顺序先后剖取肝、脾、左肾、右肾、心、肺等脏器，除去附在器官周围的脂肪组织，将表面血液吸尽，用电子天平称质量。最后计算各脏器质量与体质量的比值，即为脏器系数。

1.8 肝、脾病理切片制作及观察

取UH大鼠6只，雌雄各半，分别剖取肝、脾组织，4%多聚甲醛固定后，制作病理切片并进行HE染色，镜下观察肝和脾是否存在病理变化。

1.9 统计学处理

生物学特性相关实验数据采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，使用Pearson相关分析、独立样本t检验、单因素方差分析等方法对数据进行比较分析。

2 结果

2.1 表型特征

UH大鼠在脐部形成明显的疝囊结构并突出于体外(图1A～1B)，疝囊柔软，呈椭圆形或圆形，雄性疝囊显著大于雌性(P<0.01)，见表1。Pearson相关分析结果显示，单一性别中疝囊大小与体质量无显著相关性(P>0.05)。解剖可见脐部形成疝环结构，呈椭圆形或圆形，边缘纤维化，中间腹壁肌肉缺失，直接暴露腹腔肠道(图1C)。HE染色结果显示，UH大鼠脐部形成清晰的疝环轮廓，边缘结缔组织增厚(图2A)；SD大鼠腹中线两侧肌肉闭合紧密，结合处结缔组织完整，无异常增生现象(图2B)。

图1 UH大鼠表型特征

表1 UH大鼠疝囊大小

图2 脐部及周围组织形态

2.2 生长曲线

UH大鼠和SD大鼠生长曲线见图3。雄性UH大鼠第1～3周体质量生长趋势与雄性SD大鼠相同，第4周开始雄性UH大鼠体质量显著低于同龄SD大鼠(P<0.01)，而两种大鼠雌性体质量无显著差异。

图3 UH大鼠和SD大鼠生长曲线

2.3 血常规及血液生化指标

血常规指标和血液生化指标见表2和表3。血常规指标方面，UH大鼠部分指标在雌性和雄性中均与SD大鼠存在差异，如UH大鼠平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白量(MCH)显著低于SD大鼠(P<0.01)，红细胞体积大小的变异系数(RDW-CV)和单核细胞数目(MONO)显著高于SD大鼠(P<0.01)。此外，UH大鼠的一些血常规指标在单性别中与SD大鼠存在差异，如红细胞(RBC)、红细胞大小形状的一致程度(RDW-SD)、平均血小板体积(MPV)、降钙素原(PCY)、嗜酸性粒细胞数目(EO)、中性粒细胞数目(NEUT)、嗜碱性粒细胞(BASO)、血红蛋白(HGB)等。血液生化指标方面， UH大鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)等在雌雄个体中均明显高于SD大鼠(P<0.01)。此外，部分生化指标仅在单一性别中产生差异，如白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、尿素(UA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总蛋白(TP)、肌酐(Crea)等。

表2 UH大鼠与SD大鼠血液生理指标的比较

表3 UH大鼠与SD大鼠血液生化指标的比较

2.4 主要脏器系数

UH大鼠和SD大鼠主要脏器质量和脏器系数结果见表4和表5。UH大鼠雄性个体各主要脏器质量均大于雌性个体。雄性UH大鼠的脾脏器系数显著大于雄性SD大鼠(P<0.01)，左肾脏器系数显著小于雄性SD大鼠(P<0.05)；雌性UH大鼠的肝、脾脏器系数显著大于雌性SD大鼠(P<0.01)。UH大鼠肝和脾HE染色结果如图4所示，肝脏细胞核圆形，肝细胞未见明显变性坏死，肝组织结构正常，肝小叶内和汇管区内偶见小灶性炎，为淋巴细胞和中性粒细胞灶性浸润；脾脏白髓淋巴组织中央生发中心不明显，由幼稚的成淋巴细胞构成，外部边缘区淋巴细胞中心可见中央小动脉；红髓髓索清楚，其间髓窦充满红细胞。脾脏饱满，胞膜光滑。

表4 UH大鼠与SD大鼠主要脏器质量

表5 UH大鼠与SD大鼠主要脏器系数

图4 UH大鼠肝、脾病理结果

3 讨论

遗传性UH大鼠模型是在进行SD大鼠生产繁育过程中，偶然发现UH自发的个体，通过选种进行全同胞交配培育而成，目前已繁育至F32代。在长期的近交繁育后，UH大鼠该性状能够稳定遗传，且在体质量、脏器系数、血液生理生化指标等生物学特性均发生了不同程度的改变。成年UH大鼠的UH大小在不同性别之间差异显著，雄性疝囊显著大于雌性，而在相同性别的UH大鼠中，疝囊大小与体质量无显著相关性。UH大鼠与SD大鼠在1～8周龄间的体质量变化趋势相同，8周龄个体体质量无显著差异，而雄性UH大鼠在出生后第4周左右开始与SD大鼠产生差异，体质量增长相对缓慢，至8周龄时UH大鼠体质量显著低于SD大鼠。脏器系数方面，UH大鼠脾脏较SD大鼠明显增大，而肝脏增大仅出现于UH大鼠中的雌性个体。病理结果显示，UH大鼠脾脏无病变，肝脏可见有淋巴细胞和中性粒细胞集聚的小灶性炎。肝脏小灶性炎是SD大鼠常见的伴随性病变之一[11]，而UH大鼠由SD大鼠培育而来，因此该病变与脐疝相关的可能性较小；脾增大亦非病理性改变。 此外，UH大鼠多项生理生化指标较SD大鼠发生了显著改变。以上结果说明UH大鼠已形成独特的品系特征，所得到的各项生物学特性结果可为后续研究提供基础数据。国内外已报道的易感基因中，IL-16[12]、OSM、LIF[13]等均与免疫功能密切相关。UH大鼠模型中与免疫密切相关的脾脏较SD大鼠偏大，而血液生化结果显示MONO相较于对照组显著增高，以上结果表明UH大鼠该性状的出现可能与免疫功能的变化有关，但该结论仍需进一步实验验证。

UH是一种复杂性疾病，受环境因素和遗传因素的共同影响[14]。目前对于其致病机制的研究受限于样本数量较少、缺少合理可信的阴性对照组[15]等因素，而在易感基因研究方面，目前用于研究的动物种类各异、种群背景信息不明或差异巨大，且UH具有多基因隐性遗传及种族异质性等特征，因此已发现的易感基因在其他研究中缺少重复性验证。另外这些基因的功能亦未能在同种群中进行功能机制验证，以上原因导致易感基因的功能机制研究仍在推论阶段。本研究所培育的遗传性UH大鼠模型UH发病率保持100%，且出生后即自发UH，临床表现和病理特征与人及其他哺乳动物相似，是研究UH易感基因及功能机制的理想动物模型。