家兔PICC静脉化疗动物模型血管病理变化研究*

黄利全 陈桂园 胡庆华 胡 波 方露燕

(1. 金华职业技术学院，金华 321017)(2. 金华市中医院，金华 321017)(3. 金华市人民医院，金华 3210002)

抗肿瘤药物的化学治疗简称化疗，是肿瘤患者的三大治疗手段之一。通过外周静脉注射化疗药物时，常致静脉炎的发生，甚至出现局部皮肤溃疡、皮下组织坏死及功能障碍等严重并发症。张鹍等[1]研究认为，经外周置入中心静脉导管(peripherally inserted central catheter，PICC)指由外周静脉穿刺插管，并使其头端位于上腔静脉中下段的中心静脉导管置入术，上腔静脉处较大的血流量可迅速稀释药物，降低化疗药物对血管壁的刺激，减少化疗药物造成的局部组织红肿、疼痛或坏死。然而，PICC置管患者容易发生静脉血栓、静脉炎、感染等不良反应，影响治疗效果，甚至对患者的生命安全构成严重威胁[2-3]。由于肿瘤患者存在个体差异、不同的病因、不统一的防护方案、无法截取留置血管进行光镜观察等原因，限制了对化疗性静脉损伤的研究。因此，本研究选择酒石酸长春瑞滨注射液(以下简称长春瑞滨)建立PICC静脉化疗动物模型，对化疗性静脉损伤的发生机制和病理反应过程进行实验研究，以期为肿瘤患者探寻针对PICC相关性静脉损伤的防护措施。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级新西兰大白兔(以下称实验兔)48只，体质量1.2～2.5 kg，雌雄各半，雌兔未孕，购自金华市实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2017-0004，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2016-0008，在金华市食品药品检验检测研究院进行动物实验，经金华职业技术学院动物伦理审批，IACUC编号：2019017。实验兔随机编号，单笼饲养，按编号排列兔笼。

1.2 主要试剂与仪器

1.9 Fr×50 cm的单腔PICC导管(批号：1901002，优力捷公司)；0.9%氯化钠溶液(批次：A18122701-1，四川科伦药业股份有限公司)；酒石酸长春瑞滨注射液(批次：181001，江苏豪森药业集团有限公司)。全自动凝血分析仪RAC-030(R01001，20181225,深圳雷杜生命科技)，兽用全自动血液细胞分析仪(型号：BC-2800vet，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)； ELISA试剂盒(SEA029Ra，批次L210311678；SEA569Ra，批次L210322259；SEA079Rb，批次L210224762；SEA073Rb，批次L210323353；SEA821Rb，批次L210223758；CEA506Rb，批次L210323381，武汉云克隆科技股份有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1分组方法：对48只实验兔进行编号。随机数字表法，分为第1、2、3、7、14、21、23和24天，n=6，共完成一疗程(2个周期)的化疗。第一周期为第1～3天，第2天用药，第二周期为第22～24天，第23天用药。

1.3.2建模方法：规格为10 mg/mL的酒石酸溶解于10 mL生理盐水，按Meeh-Rubner氏公式计算家兔体表面积，确定25 mg/m2作为实验剂量，使用输液泵缓慢注射15 min，于置管后第2天和第23天各给药一次。用药毕，使用肝素盐水按脉冲式正压法封管。在化疗药物间歇期，按正规操作完成PICC置管维护，每周更换一次敷料，遇敷贴潮湿或卷边随时给予消毒和更换。

1.3.3模型评价方法：评判成功建立PICC动物模型的方法为一次穿刺成功，局部无损伤、渗血，X光透视下确定导管末端无扭曲、折叠，留置在实验兔前腔静脉。实验兔给药后存活，无严重不良反应。

1.3.4标本提取方法：每只实验兔在相应的时间点，拔除PICC留置管并用外科手术法分别在导管前、后截取两段(靠耳缘静脉端为前段、靠前腔静脉端为后段)，平均每段长约5 cm；同时截取耳缘静脉与前腔静脉，每段长约3 cm，共4个活体标本，分别在10%甲醛中固定，8组48只实验兔共计192个标本。

1.3.5静脉炎与血栓评价方法：目测观察8组静脉炎发生情况。根据闻曲等[4]报道，按照美国静脉输液护士学会2011年修订标准，结合动物实验特点，去除评价标准中有关疼痛的指标，将静脉炎分为5个等级：0级，没有症状；Ⅰ级：穿刺部位出现红斑，伴随或不伴随疼痛；Ⅱ级：穿刺部位出现红斑及疼痛，和/或水肿；Ⅲ级：穿刺部位出现红斑及疼痛，形成条状痕或纹，可触及静脉索；Ⅳ级：穿刺部位出现红斑及疼痛，形成条状痕或纹，可触及的静脉索>2.5 cm。光镜下观察其病理变化程度，从7个方面判定：①血管肿胀，血管周围水肿；②炎性细胞浸润；③管壁增厚；④管腔充血；⑤纤维增生,内皮细胞增生；⑥血管周围出血；⑦血栓形成。

1.3.6凝血指标与免疫指标监测方法：8组于置管后对应时间分别采集实验兔PICC管内静脉血，检测凝血酶原时间(PT)和血小板计数(PLT)，并采用ELISA法检测C反应蛋白(CRP)、D-二聚体(D-dimer)、E-选择素(E-Selectin)、P-选择素(P-Selectin)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)等含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 PICC化疗的静脉炎与静脉血栓发生率对比

观察各组12个静脉标本以12个PICC导管标本，目测静脉炎发生率为33.3%共8组，n=6，均为Ⅰ级静脉炎，实验组与对照组比较，虽无显著统计学差异，但明显可见第7天炎症达高峰。光镜观察静脉血栓及导管血栓发生率分别为9.38%和31.25%，实验组与对照组比较无显著统计学差异，但第21天静脉血栓与导管血栓均未发生(表1)。

表1 各组实验兔PICC化疗静脉炎与静脉血栓发生率比较

2.2 PICC化疗的静脉血管苏木素-伊红(HE)染色检测结果

PICC置管第1天(对照)耳缘静脉血管内膜不规则破溃和纤维性增生，形成瘢痕，管腔几乎闭塞，并伴少量出血。前腔静脉血管内膜不规则破溃，管壁增厚，并伴较多炎性细胞浸润。实验组：第2天(首次给药)耳缘静脉血管壁轻微破溃，并有少量血栓。前腔静脉血管内膜不规则破溃、管壁增厚，并伴少量炎性细胞浸润；第3天耳缘静脉血管内膜不规则破溃、内膜纤维性增生并无血栓。前腔静脉血管内膜变化同第2天；第7天耳缘静脉血管腔内形成瘢痕，管腔未完全闭塞。前腔静脉血管内膜较完整，管壁略增厚，并伴少量炎性细胞浸润；第14天耳缘静脉血管壁轻微破溃，少量血栓，管腔较通畅。前腔静脉血管内膜较完整，管壁正常，并伴少量炎性细胞浸润；第21天耳缘静脉血管较完整，无明显瘢痕，无血栓形成，管腔通畅。前腔静脉血管内膜较完整，管壁略增厚，并伴少量炎性细胞浸润；第23天(再次给药)耳缘静脉血管腔内形成瘢痕，管腔未完全闭塞。前腔静脉血管内膜较完整，管壁略增厚，并伴较多炎性细胞浸润；第24天耳缘静脉管腔内无明显瘢痕及血栓形成。前腔静脉内膜较完整，管壁正常，并伴少量炎性细胞浸润(图1～图2)。

图1 各组实验兔PICC化疗的耳缘静脉HE染色检测结果

图2 各组实验兔PICC化疗的前腔静脉HE染色检测结果

2.3 PICC化疗的导管HE染色检测结果

PICC置管第1天(对照)、第2天(首次给药)及第23天(再次给药)导管内均有血栓，并充满管腔。第3天导管内有血栓，占部分管腔。第7、14、21及24天导管内均无血栓(图3)。

图3 各组实验兔PICC化疗的导管HE染色检测结果

2.4 PICC化疗的凝血指标监测结果

7组实验兔PICC化疗血清中的PLT、PT及D-dimer含量各组间比较，以及与对照组比较，差异极显著(P<0.001，图4)。

图4 各组实验兔PICC化疗的凝血指标监测结果比较

2.5 PICC化疗的免疫指标监测结果

实验兔PICC化疗血清中，CRP、E-Selectin、P-Selectin、IL-2及IL-6含量各组间比较，并与对照组比较，差异极显著(P<0.001，图5)。

图5 各组实验兔PICC化疗的免疫指标监测结果比较

3 讨论

本研究发现PICC置管引起的静脉炎发生率为33.3%，静脉血栓发生率为9.38%，与李俊英[5]和王红等[6]分别报道的17%～32.3%(静脉炎)以及26.67%(静脉血栓)有差异。推测本研究静脉炎较高发生率可能与以下因素有关：(1)穿刺PICC置管过程中导管尖端错位或血管损伤，引起血管内膜受损；(2)留置导管致局部血流缓慢；(3)导管属机体异物,较快就被血浆蛋白与纤维蛋白包围，血小板聚集；(4)给药后引起血管内膜损伤等。炎症反应在留置PICC管后1 d便出现，第3天(给药后1 d)炎症加重，第7天炎症达高峰，第14天仍有小幅升高，直到第21天降至正常水平。这种静脉炎症高峰期后移以及炎症消退时间延后的现象，与王红等[7]报道的24 h出现静脉炎症反应，48 h最显著，约于1周恢复的时间有差异。推测产生以上差异的原因，除了PICC置管所致的物理性损伤外，主要与长春瑞滨刺激血管内皮细胞、血小板或嗜酸性粒细胞，致组织因子释放，静脉血管损伤有关，还与静脉血栓形成有关，如图1所示，第2天静脉管腔已出现血栓，第7天血栓基本已波及整个血管壁，直至第21天血管壁内膜完整、管腔光滑及血管损伤基本修复。可见一个化疗周期的两个疗程间歇时间安排较为合理。

本研究发现导管血栓的发生率为31.25%，明显高于静脉血栓的发生率，分析原因可能与导管内径较小，血流量较小及血流速度较慢有关。两次用药后，实验兔血液内PLT明显下降、PT缩短及D-dimer时间明显延长，提示PICC置管及使用化疗药物后，家兔处于高凝状态。Maemura等[8]和罗丹凤等[9]研究表明，因长春瑞滨属长春花碱类衍生物，该药对微管蛋白具有较高的亲和力，故能起到阻止微管蛋白聚合及诱发微管解聚等作用，达到抑制肿瘤细胞复制、分裂及增殖的目的，该药骨髓抑制程度较重，血小板减少明显[10]。Haas等[11]证实，该药致血管内皮损伤，内皮细胞表面凝血酶调节蛋白(TM)及内皮细胞蛋白C受体(EPCR)表达降低，蛋白C的活化受损，抗原提呈细胞(APC)活性减低，引起内皮细胞(VEG)促凝及抗凝活性的平衡失调；也可引起血浆蛋白C和游离蛋白S水平下降，增加纤溶酶原激活物抑制剂PAI1水平，从而产生高凝状态。同时，PICC置管产生的机械性刺激，加重损伤血管内皮细胞，增加组织因子的产生，促进凝血功能。周平等[12]研究提示，静脉血栓高发风险为D-dimer时间延长，这与本实验研究结果相符。D-dimer时间延长，可能与置管穿刺操作及化疗药物对血管造成刺激和损伤有关，经同时激活纤溶系统和凝血系统，实验兔在PICC置管第2天、第3天以及第23天家兔的D-dimer时间延长明显。

宋云霄等[13]发现，CRP与IL-6在使用化疗药物后第2天和第23天升高明显，停药5 d后降至较低水平。CRP主要用于感染性疾病的诊断，可反映机体的免疫功能和炎症水平，可与IL-6相互作用，引起炎性细胞浸润。IL-6属于具有多种免疫调节功能的一种前炎性细胞因子[14-15]，如升高说明机体处于炎症反应期。结合本实验，实验兔两次给药后，CRP与IL-6明显升高，提示化疗药物对血管内膜的刺激，导致静脉炎的发生。

本实验还分别测定了PICC置管后各时间点的E-Selectin和P-Selectin含量，E-Selectin在用药后升高，但随之小幅下降；P-Selectin含量在置管第3天达峰值。Krause等[16]和Silva等[17]报道，E-Selectin和P-Selectin作为一类重要的细胞黏附分子，在微血管和骨组织中恒定表达，当机体遭遇炎症损伤或肿瘤侵犯时，体内的E-Selectin和P-Selectin表达便会上调，介导层流条件下的白细胞在血管内皮细胞上的滚动及黏附。因此，本实验提示实验兔PICC置管早期，二者可能介导了炎症细胞迁移、黏附，参与了静脉损伤后修复的病理过程。其中，P-Selectin在血栓形成过程中起始动作用，使血小板与中性粒细胞黏附、聚集并形成血栓，上调单核细胞表达组织因子，进一步引起止血异常，导致单核细胞在损伤的血管内皮滚动与聚集，激活炎症细胞引起局部炎症反应，进一步损伤血管内皮功能。

IL-2主要由经充分活化的TH1细胞产生，属人体内一种非常重要的免疫调节因子，不仅可对T细胞分泌淋巴因子过程产生刺激和活化作用，参与到免疫调节机制中，且还可使T淋巴细胞、自然杀伤细胞及单核细胞的细胞毒活性得到显著性提升[18-20]。本实验发现，IL-2在使用化疗药物后，呈下降趋势，在第21天达峰值，说明实验兔使用长春瑞滨后，抑制TH1细胞分泌IL-2，致机体免疫力下降，经化疗间歇期的调整后，基本恢复正常。

综上，本研究在通过建立PICC化疗药物动物模型,检测不同时间点血液内凝血指标与免疫指标的含量及变化规律，探讨炎症反应的可能机制及病理变化，有助于理解各指标在血管损伤修复过程中的作用，为今后采用各指标特性进行PICC化疗静脉并发症的防护研究提供依据与思路。