多囊卵巢综合征患者血清磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达及临床意义

张颖颖，王慧玲，杨 君

(新乡医学院第一附属医院妇产科，河南 卫辉 453100)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是妇产科的常见疾病，其人群发病率为 5%～10%[1]。PCOS影响育龄期女性生殖及内分泌代谢，临床表现多为排卵障碍、高雄激素血症、胰岛素抵抗及肥胖。近年来研究发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)异常表达可能与PCOS的发病机制有关[2]。mTOR是一种在细胞内恒定表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase P,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/mTOR信号通路发挥细胞调控作用[3]。磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,p-mTOR)为mTOR的活性状态，可使mTOR信号通路发挥一系列级联反应[4]。迄今为止，mTOR与PCOS的相关研究大多局限于体外细胞培养或动物实验，而对其在PCOS患者体内的研究鲜有报道[5-7]。因此，本研究通过观察在PCOS患者血清中mTOR、p-mTOR水平变化，并分析PCOS患者血清中p-mTOR水平与肥胖、性激素、糖代谢指标的相关性，探讨p-mTOR在PCOS中的作用及机制，为后续深入开展PCOS的发病机制及治疗研究提供潜在靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2019年1月至2020年7月新乡医学院第一附属医院妇产科收治的80例PCOS患者为PCOS组，病例纳入标准：(1)符合中国人民卫生出版社第9版《妇产科学》[8]、2018年中华医学会妇产科学分会颁布的《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》[9]以及2003年鹿特丹诊断标准[10]；(2)年龄16～37岁。排除标准：(1)最近3个月内服用过激素类药物或影响检测结果的药物；(2)患有子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫内膜异位症、输卵管炎症、卵巢过度刺激征及恶性肿瘤者；(3)患有较严重的脏器疾病如心脏病、肝硬化、肾脏衰竭等；(4)患有神经精神系统疾病如焦虑、抑郁、精神分裂症等；(5)患有内分泌系统疾病如糖尿病等；(6)患有甲状腺疾病、高泌乳素血症、垂体性闭经等；(7)临床资料统计不完整。选择同期于新乡医学院第一附属医院体检的卵巢功能正常的80例女性作为对照组，纳入标准：(1)年龄17～45岁；(2)卵巢功能正常，月经规律，无不良孕产史；(3)家族中无高血压、高血脂、糖尿病及心脑血管疾病病史。PCOS组患者年龄16～37(26.76±5.66)岁，对照组受试者年龄17～42(27.43±5.85)岁；2组受试者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集收集所有受试者的身高、体质量、腰围、臀围、收缩压、舒张压，计算腰臀比及体质量指数(body mass index,BMI)。

1.2.2 性激素水平的检测2组受试者于月经周期(自然周期)第3～5天(闭经患者需停经3个月及以上)上午10：00，静息状态下静坐30 min，抽取空腹静脉血 5 mL；应用电化学发光免疫分析法检测血清黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、泌乳素(prolactin，PRL)水平，严格按试剂盒说明进行操作，IMMULITE 2000全自动微粒子化学发光免疫分析测定仪及配套试剂购自德国SIEMENS公司。

1.2.3 糖代谢指标的检测按“1.2.2”项方法抽取2组受试者静脉血5 mL，应用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)水平，AU5800全自动生物化学分析仪及专用试剂购自美国贝克曼公司，严格按试剂说明进行操作；应用电化学发光免疫分析法检测空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)水平，Roche Cobas e411全自动微粒子化学发光免疫分析测定仪及配套试剂购自瑞士罗氏公司，严格按照操作说明进行操作。计算稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)，HOMA-IR=FPG(mmol·L-1)×FINS(mU·L-1)/22.5，HOMA-IR>2.69为胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)[11]。

1.2.4 血清p-mTOR及mTOR的检测按“1.2.2”项方法抽取2组受试者静脉血5 mL，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测血清 p-mTOR及mTOR水平，血清p-mTOR 检测试剂盒购自上海酶联生物有限公司，血清mTOR检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，Bio Tek Epoch2全自动酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，严格按照试剂盒说明进行操作。

2 结果

2.1 2组受试者一般资料、性激素水平、糖代谢指标及血清p-mTOR和mTOR水平比较结果见表1。PCOS组患者BMI、T、p-mTOR、LH水平及HOMA-IR、LH/FSH值显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS组与对照组受试者的腰围、臀围、腰臀比、收缩压、舒张压、FPG、E2、P、PRL、FSH及mTOR比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组受试者一般资料、性激素水平、糖代谢指标及血清p-mTOR、mTOR水平比较

2.2 PCOS组患者血清p-mTOR水平与血清T水平、HOMA-IR、BMI相关性分析结果见图1。PCOS 患者血清 p-mTOR 水平与T、HOMA-IR呈正相关(r2=0.076、0.071，P<0.05)，与BMI无相关性(r2=0.011，P>0.05)。

A:血清p-mTOR水平与血清T水平相关性；B：血清p-mTOR水平与HOMA-IR相关性；C：血清p-mTOR水平与BMI相关性。

3 讨论

PCOS病因繁杂，目前发病机制尚不明确，疾病预防及临床治疗效果不稳定，因此，PCOS因其异质性、复杂性、治疗非特异性成为影响当今育龄期女性内分泌生殖健康的重要疾患之一。近年来，mTOR信号通路与PCOS发病机制的关系成为研究热点。研究报道，mTOR信号通路不仅在卵泡生长、发育、成熟中起重要作用，而且对卵巢颗粒细胞增殖、甾体类固醇激素合成、糖代谢、脂代谢等也发挥着重要的调控作用[12-13]。刘进[14]、KUANG等[15]研究报道，PCOS患者原代颗粒细胞及动物模型中p-mTOR的表达均高于对照组，但mTOR的表达差异无统计学意义[14-15]。本研究结果显示，PCOS组患者血清中p-mTOR 水平显著高于对照组，PCOS组与对照组受试者血清mTOR水平比较差异无统计学意义，与刘进[14]、KUANG等[15]研究结果一致；这提示，mTOR水平可能与PCOS发病机制无关，而其功能状态与PCOS发病相关；PCOS患者体内存在mTOR的异常磷酸化现象，mTOR异常磷酸化可能参与PCOS的病理生理过程。

高雄激素血症是PCOS重要的病理特征。研究表明，高雄激素血症可导致LH分泌增加，高水平的LH可间接激活PI3K/Akt/mTOR通路，刺激卵泡膜间质细胞产生过量的雄激素[13]；ESCOBAR-MORREALE等[16]研究报道，应用外源性雄激素刺激可以上调 PCOS 小鼠卵巢组织中p-mTOR的表达；马璎璇等[17]研究发现，卵巢颗粒细胞中p-mTOR的表达水平与T水平呈正相关。本研究结果显示，PCOS组患者血清中LH、T水平显著高于对照组，且血清p-mTOR水平与T水平呈正相关，说明PCOS患者体内T水平的增加与m-TOR磷酸化水平密切相关，二者共同参与了PCOS的发病过程。

研究报道，应用胰岛素刺激PCOS患者卵巢颗粒细胞可促进p-mTOR表达增多[17]；mTOR通路的异常激活也可导致IR及代偿性高胰岛素血症[18]。但有研究报道，在器官移植术后应用雷帕霉素等mTOR抑制剂可导致患者出现IR、糖耐量异常或新发糖尿病[19]。因此，当mTOR信号通路异常时机体可发生IR[20-21]，这可能是由于在生理状态下，mTOR信号通路参与体内正常的糖代谢调节过程，当mTOR信号通路出现异常，导致体内糖代谢紊乱，造成胰岛素分泌减少或敏感性下降，葡萄糖摄取及利用减少，从而导致IR或高胰岛素血症。本研究结果显示，PCOS患者血清中p-mTOR水平与IR呈正相关，这与CHEHIN等[18]研究结果一致，进一步证实了PCOS患者IR的发生与mTOR异常磷酸化存在明显相关性，说明mTOR的异常磷酸化与IR共同参与PCOS的病理生理过程。但mTOR信号通路参与PCOS-IR的作用机制仍需进一步研究。

肥胖是PCOS常见的一种临床表现特征，有研究报道，当机体处于长期肥胖状态下，mTOR被激活并发生磷酸化[22]。在PCOS患者中，肥胖可促进IR及T水平增多，而高水平的T又可导致IR的发生，IR导致高雄激素血症的发生并加重肥胖[23]，这些因素共同参与PCOS复杂的内分泌代谢紊乱过程。但本研究结果显示，PCOS组患者血清中p-mTOR水平与BMI无相关性，这与上述研究报道不符，推测可能与本研究PCOS患者中肥胖者数量较少等问题有关，需后续进一步研究。

综上所述，PCOS患者体内p-mTOR与T水平及IR的变化呈明显正相关，推测三者可能协同参与PCOS 的发生、发展，但具体作用机制仍有待进一步研究。