稀释法对抗核抗体中复合核型结果判读的影响

钱 红 朱文波 陶月 宁明哲 戴 蕾▲

1.南京鼓楼医院集团宿迁医院检验科，江苏宿迁 223800；2.南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，江苏南京 210008

抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）是抗所有核酸和核蛋白抗体的总称，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期中产生的某些成分等[1-2]。 抗核抗体的类型及滴度高低对疾病的诊断与鉴别诊断、病情评估、疗效监测及预后判断等都起着重要的作用[3-6]。目前， 国内外对ANA 检测推荐使用的方法为间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）[7-8]。 而对于IIF 结果的判读，虽然已经在向自动化探索，但国内大多数实验室依然采用经典的人工阅片。如同一标本细胞核内同时存在多种荧光模型，对于每个荧光模型的判断及其滴度的判断就很容易受到互相的干扰，甚至出现较强的荧光模型遮盖另一种较弱的荧光模型的情况发生，从而导致最终结果判读的不准确。 本文通过对细胞核复合核型进行稀释后重新判读结果，旨在提高结果的准确性，从而为临床提供更确切的诊断依据。

1 材料与方法

1.1 检测对象

采集2019年6月至8月南京鼓楼医院门诊及住院患者共计8460 份ANA 标本，从中选取初筛为细胞核复合核型的56 例标本，10 例细胞核单核型标本。56 例细胞核复合核型患者中，男8 例，女48 例；年龄15～77 岁，平均（47.2±17.4）岁；10 例细胞核单核型患者中，男1 例，女9 例；年龄24～83 岁，平均（45.8±17.6）岁。 患者于抽血后2 h 内送至检验科，当天分离血清后检测。

1.2 仪器与试剂

EUROLineMaster Plus-A 全自动免疫印迹仪、Sprinter XL 全自动间接免疫荧光操作/酶联免疫一体机均由欧蒙医学实验诊断有限公司生产，抗核抗体免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）检测试剂盒（间接免疫荧光法；批号：CD190429AA）、抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（免疫印迹法；批号：CF190604AC）均购自杭州欧蒙医学科技有限公司。

1.3 检测方法

将收集的研究标本，收集当天即分别按照1∶100、1∶1000、1∶10 000 稀释，操作步骤严格按照厂家提供的说明书进行，检测后，在EUROStar III Plus 荧光显微镜下（40×物镜）观察检测结果。 激发滤片：488 nm；分光滤镜：510 nm；阻挡滤镜：520 nm。 所有荧光显微镜判读结果均由1 名副主任技师和1 名主管技师共同阅片完成。抗核抗体谱（IgG）试剂盒检测完成后，将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判读结果。

2 结果

2.1 10 例细胞核单核型标本稀释后荧光模式分析

稀释前后的荧光核型及滴度完全一致， 见图1（封三）。

2.2 56 例细胞核复合核型标本抗核抗体谱结果及稀释后荧光模型分析

56 例细胞核复合核型标本抗核抗体谱结果及稀释后荧光模型分析见表1～2、图2～3（封三）。

图2 稀释前后的荧光核型及滴度均有改变举例（400×）

图3 稀释前后的荧光核型无变化，滴度有改变举例（400×）

表1 核型变化及抗核抗体谱结果

表2 滴度变化

3 讨论

抗核抗体的检测方法有很多种，包括IIF 法、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光免疫分析（chemiluminescence im munoassay，CLIA）等，且不同的检测方法具有各自的优缺点[9-11]。 ELISA 的优点是容易操作、标准化、定量检测及敏感性高等；缺点是需要对每项自身抗体进行逐一检测。 CLIA 的优点是敏感性高、特异性强、重复性好等；缺点是检测成本高、需对每个自身抗体进行逐一检测，速度慢。 而Hep-2 细胞属于人来源培养细胞，含大约100～150 种自身抗体，细胞核大、细胞结构清晰、易于结果观察及核型分析，被美国风湿病学会誉为ANA 检测的“金标准”[12]。虽然IIF 结果的判读已有自动化趋势[13-15]，但目前国内对于IIF 的结果判读临床应用最广泛的依然是人工方法。由于每个实验室的荧光显微镜、操作人员的专业背景以及经验积累的差异，又缺乏标准化的操作程序，会造成主观判断的标准不同，从而影响结果的准确性和重复性[16-17]。

本研究的10 例细胞核单核型标本， 稀释前后核型及滴度均无变化，说明对单核型样本的判断是准确的。 而56 例细胞核复合核型标本， 就核型和滴度分析，虽然大部分与稀释前相同，但仍出现部分核型增多或减少、滴度升高或降低的情况。

核型增多的8 例中，1 例稀释前判读为细胞核细颗粒斑点型， 稀释后判读为细胞核细颗粒斑点型、细胞核均质型，其原因可能是细颗粒斑点型荧光强度大于均质型，稀释前分裂期细胞浓缩染色体区域荧光较外周弱，但稀释后浓缩染色体区域荧光增强，故判断均质型阳性， 与抗核抗体谱中dsDNA、NUC、Hi 阳性相关。 2 例稀释前判读为细胞核均质型，稀释后判读为细胞核细颗粒斑点型、细胞核均质型，其原因可能是均质型荧光强度大于细颗粒斑点型，稀释前受分裂期细胞浓缩染色体荧光干扰导致误判，稀释后可见细胞间期核内除均匀荧光外也可见颗粒荧光，故判断细胞核细颗粒斑点型阳性， 与抗核抗体谱中SSA、SSB阳性相关。 1 例稀释前判读为细胞核粗颗粒斑点型，稀释后判读为细胞核粗颗粒斑点型、着丝点型，其原因可能是分裂间期细胞核中粗颗粒荧光影响，而分裂期细胞浓缩染色体区域也有颗粒干扰，无法辨认着丝点存在，但稀释后在分裂期细胞浓缩染色体中可见带状的浓缩点状荧光，故判断着丝点型阳性，与抗核抗体谱中CENP-B 阳性相关。 3 例稀释前判读为细胞核细颗粒斑点型， 稀释后判读为细胞核细颗粒斑点型、核仁型，其原因可能为细颗粒型荧光较强，只有部分核仁呈现阳性， 符合细颗粒斑点型荧光模型特征，但标本为1∶1000 稀释时，核仁均呈现荧光染色，故判断核仁型阳性。 1 例稀释前判读为细胞核细颗粒斑点型、核膜型，稀释后判读为细胞核细颗粒斑点型、核膜型、核点型，其原因可能为稀释前误将核点认作核中细颗粒样荧光，该标本1∶10 000 稀释时，细胞核细颗粒斑点型已看不见，核点依然可见，故判断核点型阳性。

核型减少的3 例中，1 例稀释前判读为细胞核细颗粒斑点型、核膜型、胞浆网状/线粒体型，稀释后判读为细胞核细颗粒斑点型、胞浆网状/线粒体型，其原因可能是胞浆中颗粒附着在细胞核周围形成荧光导致误判，稀释后逐一观察，与其荧光模型特征不符，最终判断核膜型阴性，稀释后判读模型与抗核抗体谱结果RO-52、AMA-M2 阳性相关。 2 例稀释前判读为细胞核细颗粒斑点型、细胞核均质型，稀释后判读为只有细胞核细颗粒斑点型， 其原因可能是分裂期细胞浓缩染色体外周区荧光太强， 误判为浓缩染色体区域有荧光， 稀释后分裂期细胞浓缩染色体外周区荧光减弱，可见浓缩染色体无荧光，故判断均质型阴性，稀释后判读模型与抗核抗体谱结果SSA、SSB 等阳性相关。

滴度升高的23 例中，当细胞核中同时存在多种荧光模型时，稀释前可能出现荧光较强的核型遮盖荧光较弱的核型的情况出现， 而随着稀释度的增加，这种遮盖效应会减弱，被遮盖的核型也显示出来。 也有报道IIF 检测高滴度的ANA 样本在低稀释度时容易产生前带效应，造成1∶100 稀释时荧光亮度反而弱于1∶1000 稀释时荧光亮度[18]。

滴度降低的8 例中，当细胞核细颗粒斑点型（或粗颗粒斑点型）和细胞核均质型同时存在于细胞核时，间期细胞核均表现为阳性，可导致荧光叠加造成滴度判读偏高。当细胞核细颗粒斑点型（或均质型）和核仁型同时存在时， 两种核型表现为不同强度荧光，据此判断滴度时，可能将荧光强度较强的模型滴度判读偏高。

综上所述，在读片时，若只做一个稀释度（1∶100），其余结果的判读就需要依靠工作人员的经验。实际临床工作中，受限于检测周转时间、成本控制等，目前大多数医院在检测ANA 时，只做一个稀释度，这样易造成漏读、错判。只做一个稀释度时，对单核型的判断影响不大；但对部分细胞核复合核型中核型及滴度的判断会造成影响。所以，当出现细胞核复合核型时，可以通过稀释的方法来协助判断。