他克莫司与环磷酰胺治疗难治性肾病综合征患儿的效果比较

刘 莹 高 健

辽宁省健康产业集团阜新矿总医院儿科，辽宁阜新 123000

肾病综合征是一组可由多种病因导致的以肾小球基膜通透性增加为主要特性的临床症候群。难治性肾病综合征（refractory nephrotic syndrome，RNS）是指患儿经8～12 周以上激素治疗病情仍未缓解的肾病综合征，且研究表明，该病病情迁延难愈易导致患儿出现感染、血栓栓塞、肾功能急性衰竭症状，严重威胁患儿身体健康[1]。 目前RNS 仍是肾病科医生治疗的难题之一，而RNS 患儿临床治疗更为棘手。临床治疗RNS常选用免疫抑制剂治疗，环磷酰胺是治疗该病常用药物， 但相关研究表明， 该药治疗RNS 整体效果不理想，且普遍存在毒副作用，易引发患儿术后不良反应，且复发性较高[2]。 他克莫司是大环内酯类新型钙调神经磷酸酶抑制剂，具有良好治疗效果[3]。 基于此，本研究旨在探究他克莫司与环磷酰胺治疗难治性肾病综合征患儿对调节性T 细胞、 体液免疫及肾功能的影响，以期为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年4月至2020年9月辽宁省健康产业集团阜新矿总医院收治的78 例RNS 患儿作为研究对象， 按照随机数字表法将其分为对照组与研究组，每组各39 例。 研究组中，男23 例，女16 例；平均年龄（8.38±1.24）岁；平均体重指数（15.2±1.8）kg/m2；病理类型：微小病变型病变13 例，局灶节段性肾小球硬化12 例，系膜增生性肾小球肾炎14 例。 对照组中，男25 例，女14 例；平均年龄（8.14±1.20）岁；平均体重指数（15.4±1.9）kg/m2；病理类型：微小病变型病变14 例，局灶节段性肾小球硬化10 例，系膜增生性肾小球肾炎15 例。两组患儿的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①患儿年龄＜14 岁；②患儿临床诊断符合诊断标准[4]；③患儿可正常沟通，听力与理解能力正常；④患儿家属对本研究知情同意。 排除标准：①继发性肾病者； ②免疫系统疾病或近期服用免疫抑制剂治疗者；③血肌酐＜133 μmol/L 或肾小球滤过率＞50 ml/min 者；④合并心、肾、肝功能损伤者；⑤对本研究药物过敏者；⑥合并恶性肿瘤、感染者。

1.3 方法

所有患儿均采取对症治疗：根据病情给予低脂、低盐与优质限蛋白饮食，常规措施治疗包括利尿消肿，抗血小板凝聚、抗感染，纠正水电解质紊乱。

对照组患儿采用环磷酰胺治疗：环磷酰胺（瀚晖制药有限公司，国药准字H20093392，生产批号：160317）10 mg/kg，与20 ml 生理盐水稀释后静脉注射，2 次/月。

研究组患儿采用他克莫司治疗：口服他克莫司（国药集团川抗制药有限公司，国药准字H20083943，生产批号：170406），初始剂量0.1～0.15 mg/（kg·d），分两次服用，治疗7～10 d 后复查患儿血药浓度，根据浓度标准（5～10 ng/ml）调整剂量，超出范围则减少20%～30%剂量。 他克莫司血药浓度检测：使用ELISA 法，经雷杜RT-6000 酶标仪 （济南来宝医疗器械有限公司）检测得出。

两组患儿均治疗6 个月。

1.4 观察指标及评价标准

比较两组患儿治疗后的临床总有效率、 调节性T细胞、外周血内皮素-1（endothelin-1，ET-1）、Toll 样受体7（Toll-like receptor 7，TLR-7）mRNA、核转录因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）、高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB-1）水平及肾功能相关指标。 （1）治疗总有效率[5]。 ①完全缓解：临床症状消失且血常规、尿蛋白、肾功能正常处于正常水平；②部分缓解：临床症状基本或大部分消失，24 h 尿蛋白减少≥50%，血清白蛋白＞30 g/L，肾功能平稳；③无缓解：临床症状无改善甚至恶化，肾功能无好转，24 h 尿蛋白减少＜50%。 总有效率=（完全缓解+部分缓解）例数/总例数×100%。 （2）调节性T 细胞。TBNK 试剂盒， 包括T 淋巴细胞抗体CD3+、CD4+、CD8+。 通过美国BD 公司Facscalibur 流式细胞仪，采用流式细胞术分析TBNK， 采用反向移液技术吸取50 μl 混匀的EDTA-K2 抗凝全血，加入计数微球管（TS Count）底部，同时加入20 μl 抗体。涡旋混匀后室温避光反应20 min。向管内加入450 μl 红细胞裂解液，涡旋振荡器上轻轻混匀约15 s，室温避光反应15 min。再次于涡旋振荡器上轻轻混匀约15 s，上机检测。 使用BDFACS Canto2.4 软件获取2500 个淋巴细胞并分析各亚群， 包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。 （3）ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平。使用ELISA 法检测ET-1、NF-κB、HMGB-1 水平，实时荧光PCR 法检测TLR-7mRNA 水平。试剂盒均供自研域（上海）化学试剂有限公司， 操作遵循试剂盒说明严格进行。（4）肾功能相关指标包括24 h 尿蛋白定量、肾小球滤过率、尿肾损伤分子-1（urine Kidney Injury Molecule-1，KIM-1）、N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D glucosaminidase，NAG）水平。 使用全自动化学发光免疫分析仪（贝克曼库尔特UniCel DxI 800，美国）测定患儿的肾功能指标； 使用ELISA 法检测KIM-1、NAG 水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验或者广义估计方程分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿治疗总有效率的比较

广义估计方程分析结果显示，组间与时点重复测量结果均有统计学意义（P＜0.05）；两组患儿治疗3、6个月后的治疗总有效率均高于治疗1 个月后， 差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗1 个月后，两组患儿的治疗总有效率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗3、6 个月后，研究组患儿的治疗总有效率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1～2）。

表2 两组治疗有效率广义方程参数估计值

2.2 两组患儿治疗前后调节性T 细胞水平的比较

治疗前，两组患儿的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗6 个月，两组患儿的CD4+、CD4+/CD8+水平均高于治疗前，CD8+水平低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗6个月， 研究组患儿的CD4+、CD4+/CD8+水平均高于对照组，CD8+水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 两组患儿治疗前后调节性T 细胞水平的比较（±s）

表3 两组患儿治疗前后调节性T 细胞水平的比较（±s）

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2.3 两组患儿治疗前后外周血ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平的比较

治疗前，两组患儿的ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗6 个月，两组患儿的ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平均低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗6 个月，研究组患儿的ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平均低于对照组， 差异有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

表4 两组患儿治疗前后外周血ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平的比较（±s）

表4 两组患儿治疗前后外周血ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平的比较（±s）

注 ET-1：外周血内皮素-1；TLR-7：Toll 样受体7；NF-κB：核转录因子κB；HMGB-1：高迁移率族蛋白1

组别 ET-1（pg/ml） TLR-7 mRNA NF-κB（ng/L） HMGB-1（ng/L）研究组（n=39）治疗前治疗6 个月后t 值P 值对照组（n=39）治疗前治疗6 个月后t 值P 值289.50±15.37 108.01±10.31 61.240＜0.001 2.90±0.50 1.52±0.32 14.518＜0.001 t 治疗前组间比较值P 治疗前组间比较值t 治疗6 个月后组间比较值P 治疗6 个月后组间比较值291.61±13.66 151.28±11.24 49.540＜0.001 0.641 0.524 17.717＜0.001 1719.51±328.58 763.25±162.62 16.289＜0.001 29.39±7.74 16.19±5.16 8.862＜0.001 2.92±0.40 1.84±0.52 10.281＜0.001 0.195 0.846 3.273＜0.001 1695.22±318.60 1252.64±219.40 7.145＜0.001 0.331 0.741 11.191＜0.001 29.05±7.34 24.27±6.54 3.036 0.003 0.199 0.843 6.057＜0.001

2.4 两组患儿治疗前后肾功能相关指标的比较

治疗前，两组患儿的24 h 尿蛋白定量、肾小球滤过率、KIM-1、NAG 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗6 个月，两组患儿的24 h 尿蛋白定量、KIM-1、NAG 水平均低于治疗前， 肾小球滤过率均高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗6 个月，研究组患儿的24 h 尿蛋白定量、KIM-1、NAG 水平均低于对照组，肾小球滤过率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表5）。

表5 两组患儿治疗前后肾功能相关指标的比较（±s）

表5 两组患儿治疗前后肾功能相关指标的比较（±s）

注 KIM-1：尿肾损伤分子-1；NAG：N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖苷酶

组别 24 h 尿蛋白定量（mg/kg） 肾小球滤过率（μmol/L） KIM-1（ng/μmol） NAG（U/mmol）研究组（n=39）治疗前治疗6 个月后t 值P 值对照组（n=39）治疗前治疗6 个月后t 值P 值115.12±22.24 14.15±3.36 28.034＜0.001 58.87±13.33 86.27±11.33 9.781＜0.001 t 治疗前组间比较值P 治疗前组间比较值t 治疗6 个月后组间比较值P 治疗6 个月后组间比较值113.91±21.39 33.30±6.45 22.533＜0.001 0.245 0.807 16.444＜0.001 0.49±0.09 0.24±0.05 15.164＜0.001 6.93±1.19 2.91±0.59 18.901＜0.001 59.10±14.29 78.59±10.48 6.868＜0.001 0.074 0.942 3.108＜0.001 0.51±0.09 0.34±0.08 8.817＜0.001 0.981 0.330 6.620＜0.001 6.80±1.12 4.23±0.79 11.710＜0.001 0.497 0.621 8.360＜0.001

3 讨论

原发性肾病综合征是常见的泌尿系统疾病，其发病机制尚不明了，但近年来有逐年上升趋势，在激素治疗过程中80%患儿对激素治疗敏感，而敏感患儿中50%会出现依赖与频复发，发展为RNS[6]。 目前，临床治疗RNS 常采取激素联合免疫抑制剂治疗方式，其目的在于在控制病情的同时减轻不良反应，但临床有关免疫抑制剂的选择上，仍存争议[7]。

环磷酰胺体外无活性，进入人体后易被肝细胞水解成醛磷酰胺再运转到组织中形成磷酰胺氮芥，干扰细胞增殖[8]。 适用于全身性红斑狼疮、儿童肾病综合征、RNS 治疗，效果确切。但因其可由脱氢酶转变为羧磷酰胺，或以丙烯醛形式排出，导致泌尿道毒性，因而临床治疗欠佳。他克莫司是从含链球菌的土壤中培养出的免疫抑制剂，临床主要用于免疫疾病治疗。 既往研究表明：他克莫司通过结合FKBP 表现出高亲和力，抑制磷脂酶活性， 阻断钙离子内流并降低其浓度，促使T 细胞核因子无法磷酸化，从而达到抑制T 细胞增生，减轻肾小球基膜电荷作用的目的；且他克莫司可通过对早期淋巴细胞聚集产生抑制，从而抑制免疫反应，阻断炎症细胞聚集，其双重抑制作用在直至免疫反应发生的同时治疗已出现免疫反应及免疫疾病[9-10]。因而推测该药可应用于治疗免疫介导发病的RNS。 本研究结果显示，组间与时点重复测量结果均有统计学意义（P＜0.05），提示环磷酰胺与他克莫司治疗RNS均具有良好效果，且他克莫司效果更好。

多数研究表明，肾病综合征属于免疫损伤疾病，患儿体内存在Treg 表达紊乱现象[11]。调节性T 细胞是维持机体免疫耐受的重要因素，通过主动调节的方式抑制自身反应性T 细胞的活化与增殖，从而调节机体免疫力[12]。 CD4+/CD8+细胞的数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生， 本研究将CD4+/CD8+细胞水平表达Treg 状况，结果显示，治疗6 个月，研究组患儿的CD4+、CD4+/CD8+水平均高于对照组，CD8+水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示他克莫司治疗组患儿治疗6 个月后免疫功能改善更明显，分析原因为：他克莫司在抑制IL-2 基因转录发挥免疫抑制作用时抑制T 细胞活性， 增强Treg表达比例[13]。研究表明，RNS 患儿免疫功能失调会使机体炎症反应增强，他克莫司在发挥高度免疫抑制作用，阻断T 细胞核因子活性，抑制T 细胞衍生因子的同时减少B 细胞自身抗体的产生来治疗肾小球疾病[14]。本研究结果显示，治疗6 个月，研究组患儿的ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1 水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。相关研究表明，TLR-7 mRNA/NF-κB 信号通路激活可提高促炎因子水平，启动适应性免疫应答，参与多种肾病发生[15]。 本研究中两组患儿的ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1水平均有所降低， 提示两种药物治疗均可有效抑制TLR-7 mRNA/NF-κB 信号通路，降低炎症反应，从而水平下降，且ET-1、TLR-7 mRNA、NF-κB、HMGB-1水平更低提示其抑制效果更好，与本文上述结论一致。

临床研究表明，RNS 病因与肾小球滤过膜通透性异常具有相关性， 其临床主要特征为大量蛋白尿，RNS 患儿若长期大量蛋白尿存在，易致使系膜细胞增生，导致肾小球硬化、肾小管损伤，加重病情[16]。 因而患儿肾功能指标变化情况也是反应临床治疗效果的有效依据。本研究结果还显示，治疗6 个月，研究组患儿的24 h 尿蛋白定量、KIM-1、NAG 水平均低于对照组，肾小球滤过率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示他克莫司治疗组患儿治疗6 个月后肾功能改善更明显，亦证实其治疗效果更佳。 分析原因为：他克莫司免疫抑制效果显著，可抑制IL-2 等细胞因子分泌，减轻炎症反应，改善肾功能。 KIM-1、NAG均为肾损害敏感标志物， 经治疗后两组患儿KIM-1、NAG 水平均下降且研究组KIM-1、NAG 水平更低，进一步提示他克莫司改善肾功能作用显著。既往研究亦表明， 他克莫司治疗RNF 患儿改善肾功能的效果明显好于环磷酰胺，与本研究结论一致[17-19]。

综上所述，他克莫司治疗难治性肾病综合征患儿的效果显著，可有效改善患儿的肾功能，值得临床应用。 但他克莫司应用于RNS 患儿治疗时需注意血药浓度检测，药物过浓易导致神经毒性，临床治疗应根据患儿的临床病情选择合适的给药方案。