王 丹, 赵承军, 陈桂生
脑缺血/再灌注损伤是缺血性脑卒中的重要的级联反应过程,多种机制作用下最终导致神经元等多种脑细胞凋亡、死亡[1],它对脑组织的损伤比缺血本身造成的损害更严重[2,3]。迄今为止,对于脑缺血/再灌注损伤仍无有效的治疗手段[4]。甲基-4-异亮氨酸环孢菌素(NIM811)是一种新型非免疫抑制性环孢菌素衍生物,它是环孢素A的同类结构药物。前期实验表明NIM811具有降低谷氨酸诱导的神经损伤的治疗潜力[5],但其在脑缺血再灌注中的研究未见报道。氧剥夺/复氧模型是一种常用的模拟体内脑缺血再灌注损伤的经典方法[6],因此,我们建立体外Na2S2O4引起小鼠H22神经元氧剥夺/复氧模型[7],探讨NIM811是否对Na2S2O4引起小鼠H22神经元缺氧/复氧的神经元具有保护作用,为研究治疗缺血性脑卒中和脑缺血再灌注损伤提供实验室依据。
1.1 试剂与仪器 HT22小鼠海马神经元细胞由宁夏颅脑疾病重点实验室提供,二氧化碳培养箱[HF240,力新仪器(上海)有限公司];全波长酶标仪(PowerWave XS2,美国Bio-tek公司);倒置相差显微镜(07中地;CKX41,奥林巴斯);倒置荧光显微镜及图像采集(Ti-S,日本Nikon);流式细胞仪(AccuriTM C6 Flow Cytometry,美国BD公司);胎牛血清(BI,舜冉上海生物科技有限公司);CCK-8检测试剂盒(日本同仁,北京智杰方远科技有限公司);Na2S2O4粉(纯品,无锡市亚泰联合化工有限司);NIM811(HY-P0025,MCE);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(KGA107,江苏凯基生物技术有限公司);活性氧(ROS)检测试剂盒(S0033,上海碧云天生物技术研究所);线粒体膜电位检测试剂盒JC-1(C2006,上海碧云天生物技术研究所);Rhod-2 AM钙离子荧光试剂(ab142780,abcam)。
1.2 NIM811溶液的配置 将5 mg NIM811溶解于4.1576 ml DMSO中,配成1 mmol/L母液。再将1 mmol/L NIM811母液用DMEM培养基稀释成600 nmol/L的工作液,分装后冷冻于-20 ℃冰箱中。
1.3 细胞分组 将HT22细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM完全培养基中,置于37 ℃,5%CO2培养箱中培养,每2~3 d传代一次。细胞分组:正常对照组、Na2S2O4组、Na2S2O4+NIM811组、IM811组,正常对照组给予换液处理;Na2S2O4组给予含2 mmol/L Na2S2O4的DMEM培养基进行缺氧1 h,然后更换为DMEM完全培养基继续培养24 h进行复氧;Na2S2O4+NIM811组提前给予600 nmol/L NIM811预处理2 h,然后换为含有2 mmol/L Na2S2O4和600 nmol/L NIM811的DMEM培养基进行缺氧1 h后,最后给予含有600 nmol/L NIM81的DMEM完全培养基进行复氧24 h;NIM811组在培养24 h后,给予含有600 nmol/L NIM811的DMEM完全培养基继续培养24 h。
1.4 细胞活性检测 按前面分组,以 5×103/孔的细胞密度接种96孔板,每组设6个复孔。在细胞培养24 h后,空白对照组给予换液处理,各实验组按1.3述方法进行处理。在实验结束前3 h,每孔加入10 μl CCK-8试剂,置于培养箱中培养3 h,用多功能酶标仪检测OD 值计算细胞存活率。
1.5 细胞凋亡的检测 按前面分组以1.5×105/ml的细胞密度接种到6孔板,每组设3个复孔,每孔2.5 ml DMEM完全培养液,按照1.3的方法处理细胞后用胰酶消化、离心并收集细胞。进行V-FITC/PI染色,室温下避光孵育15 min后,置于冰浴,于1 h内在流式细胞仪上检测。
1.6 线粒体膜电位的检测 按前面分组以1×105/ml的细胞密度接种到6孔板,每组设3个复孔,每孔2.5 ml DMEM完全培养液,按照1.3的方法处理细胞后用胰酶消化、离心并收集细胞。按照说明书进行JC-1染色,最后加入1 ml JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞,置于冰浴,于1 h内在流式细胞仪上检测。
1.7 细胞内活性氧(ROS)检测 按前面分组以2×105/ml细胞密度接种在6孔板中,每组设3个复孔,每孔2.5 ml DMEM完全培养基,混匀,转移到37 ℃培养箱中,按照1.3处理各组细胞。待实验结束后,按DCFH-DA说明书进行染色,孵育结束后,置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。
1.8 线粒体内钙离子浓度的检测(Rhod-2) 以2×105/ml细胞密度接种在6孔板中,每组设3个复孔,每孔2.5ml DMEM完全培养基,混匀,转移到37 ℃培养箱中,按照1.3处理各组细胞。待实验结束后,按照说明书进行 Rhod-2 AM染色,孵育结束后,置于荧光倒置显微镜下观察并拍照。
2.1 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性的影响 Na2S2O4组的细胞活性下降约46%(P<0.01),在给予NIM811处理后,细胞活性有明显增高38%(P<0.01)(见图1)。
图1 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损后细胞活性的影响
2.2 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞凋亡率的影响 右上角为中晚期凋亡的细胞,右下角为早期凋亡的细胞,可以通过计算早期和中晚期细胞凋亡的总数来计算细胞凋亡率。在对照组中,仍存在部分细胞凋亡,与对照组相比2 mmol/LNa2S2O4组的细胞凋亡率明显增高43%(P<0.01);给予 NIM811处理细胞后,细胞凋亡率明显减少27%(P<0.01)(见图2)。
图2 NIM811对 Na2S2O4引起的 HT22细胞凋亡率的影响
2.3 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后线粒体膜电位的影响 JC-1在正常细胞中,产生红色荧光;在细胞凋亡时,产生绿色荧光。图中右上角代表红色荧光所占百分比,右下角代表绿色荧光所占百分比,计算各组红色荧光/绿色荧光的比值来比较各组膜电位的变化。结果显示,与对照组相比,Na2S2O4组细胞凋亡明显增多,而给予NIM811处理后,红色荧光明显增多,凋亡减少,与Na2S2O4组比较,差异有统计学意义(见图3)。
图3 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损伤后线粒体膜电位的影响
2.4 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后活性氧的影响 利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。对照组中,有个别细胞荧光增强,说明在正常状态下有部分细胞活性氧水平较高;Na2S2O4组细胞荧光强度明显增强,说明细胞给予缺氧/复氧损伤后细胞活性氧水平明显增高;Na2S2O4+NIM811组中有个别细胞荧光增强,说明细胞经缺氧/复氧损伤并给予NIM811干预后,细胞活性氧水平明显好转,而NIM811组细胞荧光不明显;给予NIM811处理后,Na2S2O4+NIM811组细胞荧光强度较Na2S2O4组降低(P<0.01),差异有统计学意义,说明NIM811可以降低细胞的活性氧水平(见图4)。
图4 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损伤后活性氧的影响
2.5 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后钙离子浓度的影响 Rhod-2AM染色后观察各组细胞的钙离子荧光强度。结果显示,对照组有部分细胞荧光略强,与对照组比较,Na2S2O4组线粒体钙离子荧光强度增高,说明经Na2S2O4损伤后,细胞内钙离子水平增高。在给予NIM811干预后,Na2S2O4+NIM811组细胞钙离子荧光强度比Na2S2O4组低(P<0.01),差异有统计学意义,说明NIM811可以降低因Na2S2O4损伤引起的钙超载水平(见图5)。
图5 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损伤后钙离子水平的影响
目前已有研究证实NIM811可以减轻脑缺血后神经损伤[8]。NIM811是否可以改善脑缺血再灌注损伤还没有明确定论。本研究发现在给予NIM811处理前,Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性下降约46%(P<0.01);给予NIM811处理后,细胞活性增高38%(P<0.01),说明NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性有保护作用。即NIM811不仅可以减轻脑缺血后神经损伤。并且NIM811没有环孢素A的免疫抑制作用和毒性作用,其优点是能透过血脑屏障[9]。
研究表明脑缺血再灌注损伤是一系列因素相互影响的结果,主要与钙离子的负荷、线粒体结构破坏与功能障碍、氧自由基理论、细胞凋亡、炎症等有关[10~13]。在脑组织缺血期,以细胞坏死为主要表现形式,而在脑缺血再灌注过程中以细胞凋亡为主[14~16]。研究表明,线粒体对细胞凋亡的调控发挥重要的作用[17,18],主要是由于线粒体膜上的线粒体膜通透转换孔(MPTP)的开放,释放炎性介质及氧自由基,诱导细胞凋亡的发生。同时,线粒体缺氧后还会产生过量的活性氧(ROS),并导致钙离子内流,使得线粒体膜电位去极化[19]。这些事件的发生最终会进一步诱发细胞凋亡,从而加重脑组织损伤。目前认为,脑缺血再灌注损伤后,细胞内钙超载可以破坏线粒体的结构与功能[20,21]。本研究观察到,在Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后的细胞凋亡率明显增高43%(P<0.01),说明在Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧时存在细胞凋亡的现象;给予 NIM811处理细胞后,细胞凋亡率明显减少27%(P<0.01),说明NIM811可以改善因Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后的细胞凋亡,尤其是抑制细胞早期凋亡。同时本实验观察在Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧时引起线粒体膜电位变化,活性氧增多,钙超载现象。给予NIM811处理后,观察到NIM811减轻了Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后引起线粒体膜电位超极化,抑制活性氧增多,减少钙超载。证明NIM811可以提高Na2S2O4引起HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性,推测在脑缺血再灌注时,NIM811可能与线粒体通透性转换孔上的亲环蛋白D结合,阻断线粒体通透性转换孔MTPT的开放,保护受损的线粒体,抑制细胞凋亡,从而减轻神经元的损伤。即对再灌注后神经损伤也有保护作用。
综上所述,NIM811对于HT22细胞缺氧/复氧损伤后维护线粒体动力学平衡和抑制细胞凋亡有重要的意义,这对未来研究治疗缺血性脑卒中和脑缺血再灌注损伤的药物时,NIM811作为一种候选药物提供了实验室依据。