NIM811对Na2S2O4引起小鼠HT22细胞缺氧/复氧损伤的保护作用的研究

王 丹， 赵承军， 陈桂生

脑缺血/再灌注损伤是缺血性脑卒中的重要的级联反应过程，多种机制作用下最终导致神经元等多种脑细胞凋亡、死亡[1]，它对脑组织的损伤比缺血本身造成的损害更严重[2,3]。迄今为止，对于脑缺血/再灌注损伤仍无有效的治疗手段[4]。甲基-4-异亮氨酸环孢菌素(NIM811)是一种新型非免疫抑制性环孢菌素衍生物，它是环孢素A的同类结构药物。前期实验表明NIM811具有降低谷氨酸诱导的神经损伤的治疗潜力[5]，但其在脑缺血再灌注中的研究未见报道。氧剥夺/复氧模型是一种常用的模拟体内脑缺血再灌注损伤的经典方法[6]，因此，我们建立体外Na2S2O4引起小鼠H22神经元氧剥夺/复氧模型[7]，探讨NIM811是否对Na2S2O4引起小鼠H22神经元缺氧/复氧的神经元具有保护作用，为研究治疗缺血性脑卒中和脑缺血再灌注损伤提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 HT22小鼠海马神经元细胞由宁夏颅脑疾病重点实验室提供，二氧化碳培养箱[HF240，力新仪器(上海)有限公司]；全波长酶标仪(PowerWave XS2，美国Bio-tek公司)；倒置相差显微镜(07中地；CKX41，奥林巴斯)；倒置荧光显微镜及图像采集(Ti-S，日本Nikon)；流式细胞仪(AccuriTM C6 Flow Cytometry，美国BD公司)；胎牛血清(BI，舜冉上海生物科技有限公司);CCK-8检测试剂盒(日本同仁，北京智杰方远科技有限公司);Na2S2O4粉(纯品，无锡市亚泰联合化工有限司);NIM811(HY-P0025，MCE);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(KGA107，江苏凯基生物技术有限公司);活性氧(ROS)检测试剂盒(S0033，上海碧云天生物技术研究所);线粒体膜电位检测试剂盒JC-1(C2006，上海碧云天生物技术研究所);Rhod-2 AM钙离子荧光试剂(ab142780，abcam)。

1.2 NIM811溶液的配置 将5 mg NIM811溶解于4.1576 ml DMSO中，配成1 mmol/L母液。再将1 mmol/L NIM811母液用DMEM培养基稀释成600 nmol/L的工作液，分装后冷冻于-20 ℃冰箱中。

1.3 细胞分组 将HT22细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM完全培养基中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，每2～3 d传代一次。细胞分组：正常对照组、Na2S2O4组、Na2S2O4+NIM811组、IM811组，正常对照组给予换液处理；Na2S2O4组给予含2 mmol/L Na2S2O4的DMEM培养基进行缺氧1 h，然后更换为DMEM完全培养基继续培养24 h进行复氧；Na2S2O4+NIM811组提前给予600 nmol/L NIM811预处理2 h，然后换为含有2 mmol/L Na2S2O4和600 nmol/L NIM811的DMEM培养基进行缺氧1 h后，最后给予含有600 nmol/L NIM81的DMEM完全培养基进行复氧24 h；NIM811组在培养24 h后，给予含有600 nmol/L NIM811的DMEM完全培养基继续培养24 h。

1.4 细胞活性检测 按前面分组，以 5×103/孔的细胞密度接种96孔板，每组设6个复孔。在细胞培养24 h后，空白对照组给予换液处理，各实验组按1.3述方法进行处理。在实验结束前3 h，每孔加入10 μl CCK-8试剂，置于培养箱中培养3 h，用多功能酶标仪检测OD 值计算细胞存活率。

1.5 细胞凋亡的检测 按前面分组以1.5×105/ml的细胞密度接种到6孔板，每组设3个复孔，每孔2.5 ml DMEM完全培养液，按照1.3的方法处理细胞后用胰酶消化、离心并收集细胞。进行V-FITC/PI染色，室温下避光孵育15 min后，置于冰浴，于1 h内在流式细胞仪上检测。

1.6 线粒体膜电位的检测 按前面分组以1×105/ml的细胞密度接种到6孔板，每组设3个复孔，每孔2.5 ml DMEM完全培养液，按照1.3的方法处理细胞后用胰酶消化、离心并收集细胞。按照说明书进行JC-1染色，最后加入1 ml JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞，置于冰浴，于1 h内在流式细胞仪上检测。

1.7 细胞内活性氧(ROS)检测 按前面分组以2×105/ml细胞密度接种在6孔板中，每组设3个复孔，每孔2.5 ml DMEM完全培养基，混匀，转移到37 ℃培养箱中，按照1.3处理各组细胞。待实验结束后，按DCFH-DA说明书进行染色，孵育结束后，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.8 线粒体内钙离子浓度的检测(Rhod-2) 以2×105/ml细胞密度接种在6孔板中，每组设3个复孔，每孔2.5ml DMEM完全培养基，混匀，转移到37 ℃培养箱中，按照1.3处理各组细胞。待实验结束后，按照说明书进行 Rhod-2 AM染色，孵育结束后，置于荧光倒置显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性的影响 Na2S2O4组的细胞活性下降约46%(P<0.01)，在给予NIM811处理后，细胞活性有明显增高38%(P<0.01)(见图1)。

图1 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损后细胞活性的影响

2.2 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞凋亡率的影响 右上角为中晚期凋亡的细胞，右下角为早期凋亡的细胞，可以通过计算早期和中晚期细胞凋亡的总数来计算细胞凋亡率。在对照组中，仍存在部分细胞凋亡，与对照组相比2 mmol/LNa2S2O4组的细胞凋亡率明显增高43%(P<0.01)；给予 NIM811处理细胞后，细胞凋亡率明显减少27%(P<0.01)(见图2)。

图2 NIM811对 Na2S2O4引起的 HT22细胞凋亡率的影响

2.3 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后线粒体膜电位的影响 JC-1在正常细胞中，产生红色荧光；在细胞凋亡时，产生绿色荧光。图中右上角代表红色荧光所占百分比，右下角代表绿色荧光所占百分比，计算各组红色荧光/绿色荧光的比值来比较各组膜电位的变化。结果显示，与对照组相比，Na2S2O4组细胞凋亡明显增多，而给予NIM811处理后，红色荧光明显增多，凋亡减少，与Na2S2O4组比较，差异有统计学意义(见图3)。

图3 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损伤后线粒体膜电位的影响

2.4 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后活性氧的影响 利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。对照组中，有个别细胞荧光增强，说明在正常状态下有部分细胞活性氧水平较高；Na2S2O4组细胞荧光强度明显增强，说明细胞给予缺氧/复氧损伤后细胞活性氧水平明显增高；Na2S2O4+NIM811组中有个别细胞荧光增强，说明细胞经缺氧/复氧损伤并给予NIM811干预后，细胞活性氧水平明显好转，而NIM811组细胞荧光不明显；给予NIM811处理后，Na2S2O4+NIM811组细胞荧光强度较Na2S2O4组降低(P<0.01)，差异有统计学意义，说明NIM811可以降低细胞的活性氧水平(见图4)。

图4 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损伤后活性氧的影响

2.5 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后钙离子浓度的影响 Rhod-2AM染色后观察各组细胞的钙离子荧光强度。结果显示，对照组有部分细胞荧光略强，与对照组比较，Na2S2O4组线粒体钙离子荧光强度增高，说明经Na2S2O4损伤后，细胞内钙离子水平增高。在给予NIM811干预后，Na2S2O4+NIM811组细胞钙离子荧光强度比Na2S2O4组低(P<0.01)，差异有统计学意义，说明NIM811可以降低因Na2S2O4损伤引起的钙超载水平(见图5)。

图5 NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞损伤后钙离子水平的影响

3 讨 论

目前已有研究证实NIM811可以减轻脑缺血后神经损伤[8]。NIM811是否可以改善脑缺血再灌注损伤还没有明确定论。本研究发现在给予NIM811处理前，Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性下降约46%(P<0.01)；给予NIM811处理后，细胞活性增高38%(P<0.01)，说明NIM811对Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性有保护作用。即NIM811不仅可以减轻脑缺血后神经损伤。并且NIM811没有环孢素A的免疫抑制作用和毒性作用，其优点是能透过血脑屏障[9]。

研究表明脑缺血再灌注损伤是一系列因素相互影响的结果，主要与钙离子的负荷、线粒体结构破坏与功能障碍、氧自由基理论、细胞凋亡、炎症等有关[10～13]。在脑组织缺血期，以细胞坏死为主要表现形式，而在脑缺血再灌注过程中以细胞凋亡为主[14～16]。研究表明，线粒体对细胞凋亡的调控发挥重要的作用[17,18]，主要是由于线粒体膜上的线粒体膜通透转换孔(MPTP)的开放，释放炎性介质及氧自由基，诱导细胞凋亡的发生。同时，线粒体缺氧后还会产生过量的活性氧(ROS)，并导致钙离子内流，使得线粒体膜电位去极化[19]。这些事件的发生最终会进一步诱发细胞凋亡，从而加重脑组织损伤。目前认为，脑缺血再灌注损伤后，细胞内钙超载可以破坏线粒体的结构与功能[20,21]。本研究观察到，在Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后的细胞凋亡率明显增高43%(P<0.01)，说明在Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧时存在细胞凋亡的现象；给予 NIM811处理细胞后，细胞凋亡率明显减少27%(P<0.01)，说明NIM811可以改善因Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后的细胞凋亡，尤其是抑制细胞早期凋亡。同时本实验观察在Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧时引起线粒体膜电位变化，活性氧增多，钙超载现象。给予NIM811处理后，观察到NIM811减轻了Na2S2O4引起的HT22细胞缺氧/复氧损伤后引起线粒体膜电位超极化，抑制活性氧增多，减少钙超载。证明NIM811可以提高Na2S2O4引起HT22细胞缺氧/复氧损伤后细胞活性，推测在脑缺血再灌注时，NIM811可能与线粒体通透性转换孔上的亲环蛋白D结合，阻断线粒体通透性转换孔MTPT的开放，保护受损的线粒体，抑制细胞凋亡，从而减轻神经元的损伤。即对再灌注后神经损伤也有保护作用。

综上所述，NIM811对于HT22细胞缺氧/复氧损伤后维护线粒体动力学平衡和抑制细胞凋亡有重要的意义，这对未来研究治疗缺血性脑卒中和脑缺血再灌注损伤的药物时，NIM811作为一种候选药物提供了实验室依据。