香菇新品种“农香152”的选育*

李昕霖

（福建省食用菌技术推广总站，福建 福州 350003）

香菇（Lentinus edodes），别名香蕈、香菌、冬菇等，属担子菌纲（Basidiomycotina） 伞菌目（A－garicales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香菇属（Lentinus），是一种高蛋白、低脂肪的营养保健食品，其香气特殊，味道鲜美，营养丰富，且具有抗病毒、抗肿瘤、抗癌症、调节免疫、降血脂等多种功能，被誉为“山珍之王”[1-4]。香菇是世界上发展最快的菇类，我国又是全球主要的香菇生产国、消费国和出口国，市场潜力巨大[5]。而传统的“一家一户”粗放式栽培模式在气候要求、生长周期、生产成本、劳动强度等方面存在诸多弊端[6-7]，已无法满足产业快速发展的需求，工厂化则具有实现周年生产、机械化程度高、生产成本较低等优势，顺应了现代食用菌发展的趋势。因此，培育适合工厂化栽培的香菇品种，可促进香菇工厂化的发展。

香菇属于四极性异宗结合的食用菌[8]，通过品种间杂交很容易产生有结实能力的双核菌丝[9]。杂交育种的主要方法有单孢杂交、双单杂交和多孢杂交[10]，目前单孢杂交育种是香菇育种中最常用的手段之一[11-13]，多孢杂交方法操作简单，也可筛选出比亲本更加优良的品种[14]。香菇杂交菌株常用的鉴定技术为形态学鉴定、拮抗以及简单重复序列间扩增（ISSR）、简单重复序列（SSR）、相关序列扩增多态性（SRAP）等[15]，通常采用拮抗与DNA指纹图谱相结合鉴定品种[16]。为了选育适合工厂化栽培的香菇新品种，试验采用多孢杂交技术，并结合拮抗试验和ISSR、SRAP分子技术进行杂交子的特异性鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

亲本菌株：香菇101由福建省三明市尤溪县洋中镇香菇菇农提供，香菇L18和L19由福建省龙岩市永定区农业局提供，为当地的主栽品种，香菇SK11由福建省福州市罗源县起步镇香菇菇农提供，为工厂化栽培品种。

1.2 培养基

PDA培养基：去皮马铃薯250 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然。液体培养基：玉米粉15 g、黄豆粉10 g、葡萄糖10 g、VB110 mg、VB210 mg，水2 000 mL。栽培培养基：粗木屑30%、细木屑25%、玉米芯30%、麸皮15%、石膏1%，含水量62%，pH自然。

1.3 孢子收集

取香菇101、L18、L19和SK11成熟的子实体各3朵，切除菌柄，将菌盖朝下置于灭菌后的平皿中，于超净工作台过夜收集孢子印，孢子印放4℃冰箱保存备用。

1.4 多孢杂交

用无菌环刮取孢子印5环至5 mL无菌水，混匀后备用。取不同菌株的孢子悬浮液各100 μL混合后涂布于PDA平板进行两两菌株的多孢杂交，其中SK11是一株适合工厂栽培的菌株，因此进行了多孢自交，以期获得产量更高的杂交菌株；菌株接种各重复5皿，25℃恒温培养10 d～15 d，移取一小块菌落至新鲜的PDA平板进行纯化，并用显微观察锁状联合，有锁状联合的菌株即为杂交子。

1.5 出菇试验

配制液体培养基，取600 mL装入1 000 mL三角瓶中，经高压灭菌后备用。获得的杂交子制作试管菌种，从试管种中移取5小块接入液体培养基，25℃，160 r·min-1振荡培养7 d。采用 18 cm×35 cm×0.05 cm的聚丙烯塑料袋，使用窝口打包机装料，每袋装料湿重约1 100 g，每袋接种量约为20 mL，置于23℃～25℃菇房培养，待菌丝生理成熟后，转移至出菇房，出菇管理的主要参数为12℃～15℃、相对湿度80%～95%、二氧化碳浓度＜0.1%，光照强度200 lx。记录子实体采收日期、出菇周期、产量、菌盖直径、厚度、菌柄直径及长度等数据。

1.6 品种特异性试验

1.6.1 拮抗试验

按无菌操作要求，用直径8 mm的打孔器在菌落边缘挖取菌种块，交叉接种到9 cm的PDA培养基平板上[17]，两菌种间约1 cm。25℃培养，当试验品种的菌落接触后继续培养5 d～7 d，观察菌落生长和拮抗情况。

1.6.2 DNA提取

按参考文献[18]中的CTAB法提取菌株DNA。

1.6.3 ISSR分子鉴定

ISSR-PCR扩增条件和扩增体系参照参考文献[19]，所选用的引物见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ISSR引物Tab.1 ISSR primers

1.6.4 SRAP分子鉴定

SRAP-PCR前引物Me和后引物Em相互组合成16对引物，扩增条件和扩增体系参照参考文献[20]，引物统计见表2。

表2 SRAP引物Tab.2 SRAP primers

2 结果与分析

2.1 多孢杂交子获得及初筛

以福建省农作物品种审定委员会认定的香菇新品种农香2号作为对照菌株，香菇菌株杂交子的筛选结果见表3。

表3 杂交子筛选结果Tab.3 Hybridization and screening results

由表3可知，以 101×L18、101×L19、101×SK11和SK11×SK11共4个组合进行多孢杂交或多孢自交，挑起萌发的菌落269个，经镜检含有锁状联合的数量为223个，即多孢杂交子，编号为Le0001～Le0223。对获得的杂交子进行出菇试验，有97个可以正常出菇，正常出菇比例为43.5%，余下杂交子不出菇或子实体不正常。97个杂交子中16个产量高于对照菌株。

2.2 杂交菌株的复筛试验

将初筛获得的16株产量高于对照菌株的杂交子进行出菇复筛，以4个亲本和已认定的品种农香2号作对比，记录满袋时间，统计第一潮鲜菇产量、子实体的含水量等，结果统计见表4。

表4 杂交菌株出菇试验结果Tab.4 fruiting test of hybrid strains

由表4试验结果可知，杂交菌株的满袋时间在25 d～39 d；亲本菌株的菌丝在培养料上生长能力较快，5个亲本菌株中除SK11外，其余4个菌株的满袋时间均为25 d，显示出较强的菌丝活力；16个杂交子中，Le0055、 Le0059、Le0064、Le0153和Le0191菌株的满袋时间较短。在第一潮菇产量方面，亲本菌株L18、L19和SK11的产量超过200 g/袋，也显示较大的优势。仅有Le0152杂交子的产量较高，鲜菇达325 g/袋，产量远高于栽培品种；干菇重量达20.8 g/袋，也比对照高。Le0152杂交子的子实体含水量较高，为93.6%，产品可以鲜销为主。因此，对Le0152杂交子进行进一步生产性试验。

2.3 杂交子Le0152生产试验结果

对杂交子Le0152进行生产性试验，连续4批次栽培以观察其性状的稳定性，以亲本SK11和已认定的品种农香2号作对比，其生产性试验结果见表5，子实体性状见图1。

表5 农香152生产性试验结果Tab.5 Production test of Nongxiang 152

图1 农香152子实体Fig.1 Fruit body of Nongxiang 152

从表5可以看出，杂交子Le0152的产量稳定，4批次的第一潮产量均超过300 g/袋，比对照农香2号增产264.3%，比亲本SK11增产60.2%，优势显著；且其栽培周期短，从接种至第一潮采收仅69 d，比对照农香2号缩短7 d。从图1子实体朵形上看，杂交子Le0152朵形圆整，子实体厚实致密，数量多，个头较小，菌盖浅褐色至棕色；菌盖直径与厚度比亲本和对照菌株小，但其菌柄较短，菌盖直径与菌柄长度和菌柄直径的比值分别是1.49和3.96。

2.4 品种特异性试验结果

2.4.1 拮抗试验

杂交子农香152与亲本SK11及对照品种农香2号的拮抗试验结果见图2。

图2 拮抗试验Fig.2 Antagonistic experiment

由图2试验结果可知，杂交子农香152与亲本SK11及对照品种农香2号有较明显的拮抗线，认为3个菌株为不同品种。

2.4.2 ISSR和SRAP分子鉴定

从5个ISSR引物中，筛选到ISSR12和ISSR13可以将农香152与亲本SK11和对照品种农香2号相区别的DNA指纹图谱，结果见图3。

图3 农香152菌株ISSR鉴定电泳图Fig.3 Electrophoresis diagram of ISSR identification of Nongxiang 152 strain

由图3可知，引物ISSR12扩增出2个明显的条带将农香152、SK11和农香2号相互区别，同时引物ISSR13有1个条带将农香152与亲本SK11进行区分。

从16对SRAP引物组合中，筛选到Me1/Em3、Me1/Em6、Me1/Em13、Me2/Em10和Me2/Em13引物能将农香152与亲本SK11和对照品种农香2号相区别的DNA指纹图谱，结果见图4。

图4 农香152菌株SRAP鉴定电泳图Fig.4 Electrophoresis diagram of SRAP identification of Nongxiang 152 strain

由图4可知，引物Me1/Em3、Me1/Em6、Me1/Em13、Me2/Em10和Me2/Em13引物分别扩增出1个的条带将农香152、SK11和农香2号相互区别。

ISSR和SRAP多态性分析结果表明，农香152既具有与其亲本SK11相同的条带，也具有与其亲本不同的条带，表明该杂交种是亲本多孢自交后遗传物质发生重新组合得到；其与农香2号也有明显不同，表明农香152和农香2号是不同的菌株。因此，DNA分子鉴定结果表明这3个菌株各具特异性，是不同的品种。

3 结论与讨论

农香152号子实体单生，菌盖呈圆形，淡褐色，菌肉厚实致密，菌伞直径约为3.9 cm，菌盖厚约为1.5 cm，周围有部分白色鳞片，菌柄直径1.3 cm，长度2.4 cm。子实体较小，数量多，为低温出菇型品种，菌丝培养温度22℃～25℃，温度过高，菌丝体稀疏，PDA培养基上长势慢；子实体发育温度12℃～14℃，温度过高容易开伞；生物转化率达85%左右，子实体第一潮出菇集中产量高达340 g/袋，出菇周期短，未经转色可出菇，接种69 d即可采收。

试验以产量高、出菇整齐、栽培周期短、品质优良、子实体组织紧实为育种目标，筛选出性状优良、适合工厂化栽培的香菇新菌株农香152。其具有产量高，出菇周期短，不经转色即可出菇，第一潮出菇集中等突出特点，尤其适合工厂化栽培。并通过拮抗试验和ISSR、SRAP分子鉴定，确认农香152号是一个新菌株品种。为丰富和创新香菇种质资源，进一步推动香菇工厂化栽培奠定基础。