珍稀食用菌紫陀螺菌三峡区域资源调查与化学成分分析*

谭爱华，李方桥**，邓梦匀，胡飞飞

（1.湖北三峡职业技术学院，湖北 宜昌 443000；2.三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002）

紫陀螺菌 [Gomphus purpuraceu(Iwade)Yokoyamas]隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina） 非褶菌目（Aphyllophorales） 陀螺菌科（Gomphaceae） 陀螺菌属（Gomphus）[1]。作为一种珍稀食用菌，紫陀螺菌味道鲜美、营养丰富，且含有蛋白质、维生素、糖类以及微量元素等多种营养成分，同时具有易保鲜、易加工等特点，在食品和药品领域具有很大的开发价值[2]。但是目前国内对紫陀螺菌的研究报道甚少，据现有对紫陀螺菌子实体化学成分的研究报道[3]，已从紫陀螺菌子实体中分离得到6种化合物，分别为 ergosta-4，6，8 （14），22-tetraen-3-one、4-hydroxy-4-methylpentan-2-one、5，8-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol、methyl 1H-indole-3-carboxylate、3β，5α，9α-trihydroxyergosta-7，22-diene-6-one、purpuracolide。基于上述背景，对紫陀螺菌的形态特征、生长环境及分布进行了初步调查。现将紫陀螺菌三峡区域的资源调查及其化学成分的提取、分离与鉴定情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

紫陀螺菌子实体来源于中国三峡地区西陵峡河谷区，由珍稀食用菌紫陀螺菌菌种繁育技术研究课题组保存。

1.2 试验仪器

FA2204B（0.1 mg）电子分析天平，上海越平科学仪器有限公司；N-1100旋转蒸发仪，日本EYELA仪器公司；Bruker-ARX-400核磁共振谱仪，瑞士Bruker公司；Waters高效液相色谱仪1525EF，美国WATERS；Dionex高效液相色谱仪Ultimate 3000，美国Dionex；制备型色谱柱： YMC-Pack ODS-A C18，5 Y，100Å，100ÅC-Pa；薄层层析用硅胶GF254：200目～300目柱层层析硅胶，青岛海洋化工厂生产；Sephadex LH 20葡聚糖凝胶，Merk公司产品；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 紫陀螺菌三峡区域的资源调查

对西陵峡河谷区紫陀螺菌资源现状进行了走访和实地调查，观察并记录紫陀螺菌的地理分布、生长环境及主要形态特征。此外，在紫陀螺菌生长地宜昌市兆吉坪村八组林地进行定点观测，选择了3个样地，观测其地形、海拔、植被、气候、土壤等环境因子与紫陀螺菌生长发育的关系。

1.3.2 化学成分的提取与分离

取干燥的紫陀螺菌子实体粉末160 g，用3倍体积甲醇浸提，共3次，每次12 h。提取液合并后减压浓缩得到总浸膏10 g，将浸膏在水中充分混悬后，分别用石油醚（料液比1∶2）、二氯甲烷（料液比1∶3）、乙酸乙酯（料液比1∶2） 等有机溶剂萃取；减压浓缩后得到石油醚萃取相2.304 3 g、二氯甲烷萃取相0.716 0 g、乙酸乙酯萃取相0.272 0 g、水相6.844 8 g。经HPLC分析，二氯甲烷和水相片段化学成分较为单一，适合快速分离鉴定。

二氯甲烷萃取浸膏经葡聚糖凝胶柱层析，二氯甲烷∶甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到23个洗脱片段（GD1～GD23），经TLC分析，合并洗脱片段GD10～GD15和GD16～GD23，分别标记为GD10（621 mg）和GD16（351.3 mg）。GD10经正相硅胶柱层析和薄层硅胶层析分离纯化，得到纯度较高的片段G10-1，为化合物1。GD16经正相硅胶柱层析分离纯化得到洗脱片段1～21，经TLC分析，合并洗脱片段3～5，标记为G16-3，经HPLC分离纯化（HPLC条件：甲醇10%，波长254 nm；流速2 mL·min-1；洗脱时间20 min），得到纯度较高的片段G16-3-2，为化合物2。

水相浸膏以甲醇溶液（0～100%）为洗脱剂，分段洗脱，经反相硅胶柱层析分离，纯化得到40个洗脱片段（GOP-Z-W-1～GOP-Z-W-40）；后经HPLC分析（HPLC条件：10%～100%乙腈溶液梯度洗脱40 min，100%乙腈洗脱10 min，波长254 nm；流速1 mL·min-1），合并得到纯度较高的片段GOP-Z-W-1，为化合物3，片段GOP-Z-W-18经HPLC制备得到化合物4。

将紫陀螺菌菌株进行适宜条件发酵，发酵液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取相。乙酸乙酯萃取相经HPLC（以24%甲醇30 min变梯度到80%甲醇为洗脱条件，变梯度制备）分离，得到化合物5。

1.3.3 化合物的结构鉴定

通过核磁共振谱仪对化合物1（G10-1）、化合物2（G16-3-2）、化合物3（GOP-Z-W-1）、化合物4（GOP-Z-W-18）、化合物5进行结构鉴定，分析得到各化合物的结构。

2 结果与分析

2.1 分布范围和生长环境

紫陀螺菌主要分布在西陵峡南岸、海拔400 m～800 m的山脊及山腰中（碑垭、鲍家桩、兆吉坪一带）。子实体为单生、丛生或者群生于林中地，且大多呈带状分布，长达数米。易生长在直径20 cm以上的青冈栎、黄栌树或马尾松树蔸附近。

2.2 发生季节与气候特征

紫陀螺菌子实体的发生季节一般为每年的6月下旬～9月中旬（最迟可延至11月上旬），前后共发生三潮～四潮，高峰期为7月上中旬。子实体生长期间的日平均气温为20℃～28℃，空气相对湿度为75%～85%。其发生量还与降雨密切相关，若长期干旱或下雨，发生量较少；晴雨交替，发生量较大。紫陀螺菌子实体生长速度缓慢，成熟期15 d～20 d，若光线较强其生长速度更慢。由此可见，紫陀螺菌子实体易生长在光线阴暗且潮湿的林地。

2.3 定点观测结果

实地采样的紫陀螺菌子实体见图1。

图1 紫陀螺菌子实体Fig.1 Fruit body of Gomphus purpuraceus

紫陀螺菌生长地多为阔叶混交林（以青冈栎、黄栌树为主），林高7 m左右，林间郁闭度70%～80%。林地土壤为碳酸盐类黄棕壤，偏酸性，pH 6.0左右，可能与其他微生物的活动、共生植物根系的分布及土壤松散多石、透气性较好有关。

2.4 化合物的结构鉴定与分析

2.4.1 邻苯二甲酸-双（2’-乙基庚基） 酯

化合物1（G10-1） 为邻苯二甲酸-双（2’-乙基庚基）酯[phthalic acid-bis（2’-ethyl heptanyl）easter]，黄色油状物，化学式为C26H42O4，其化学结构见图2。

图2 化合物1的化学结构Fig.2 Chemical structures of compound 1

化合物1的核磁共振图谱数据如下。

1）1H-NMR（400 MHz，CDCl3）的化学位移（δ）：7.71 （2H，dd，J=3.2，5.6 Hz，H-3，6），7.53（2H，dd，J=3.2，5.6 Hz，H-4，5），4.30（4H，m，H-1′，1″），1.72 （2H，m，H-2′，2″），1.39 （20H，m，10×CH2），0.96（6H，t，J=7.6 Hz，H-b′，b″），0.90（6H，t，J=6.4 Hz，H-7′，7″）。

2）13C-NMR（100 MHz，CDCl3）的化学位移（δ）：167.7（2 × C=0），132.5（C-1，2），130.9（C-3，6），128.8 （C-4，5），68.1 （C-1′，1″），38.7 （C-2′，2″），30.4 （C-3′，3″），29.7 （C-4′，4″），28.9 （C-5′，5″），23.7 （C-6′，6″），23.0 （C-a′，a″），14.1（C-7′，7″），11.0（C-b′，b″）。

根据G10-1的碳谱、氢谱数据，与参考文献[5]报道的谱图数据基本吻合，由此确定化合物1为邻苯二甲酸-双（2’-乙基庚基）酯。

2.4.2 邻苯二甲酸-二（2-乙基己基）酯

化合物2（G16-3-2） 为邻苯二甲酸-二（2-乙基己基）酯[Bis（2-ethlhexyl）phthalate]，又称邻苯二甲酸二辛酯，无色透明液体，化学式为C24H38O4，其化学结构见图3。

图3 化合物2的化学结构Fig.3 Chemical structures of compound 2

化合物2的核磁共振图谱数据如下。

1）1H-NMR（400 MHz，CDCl3）的化学位移（δ）：7.72 （2H，dd，J=3.4，5.7 Hz，H-2），7.52（2H，dd，J=3.4，5.7 Hz，H-3），4.26（4H，d，J=6.5 Hz，H-1′），1.77 （2H，m，H-2′），1.26 （16H，m，H-3′，4′，5′，7′），0.94 （6H，t，J=7.4 Hz，H-8′），0.88（6H，t，J=7.8Hz，H-6′）。

2）13C-NMR（100 MHz，CDCl3）的化学位移（δ）：167.8（CO），132.4（C-1），130.9（C-3），128.8 （C-2），68.2 （C-1′），38.8 （C-2′），30.4（C-3′），29.0（C-4′），23.8（C-7′），23.0（C-5′），14.0（C-6′），11.0（C-8′）。

根据G-16-3-2的碳谱、氢谱数据，与参考文献[4]报道的谱图数据基本吻合，由此确定化合物2为邻苯二甲酸-二（2-乙基己基） 酯。

2.4.3 D-半乳糖醇

化合物3（GOP-Z-W-1） 为D-半乳糖醇（D-galactitol），无色结晶粉末，化学式为C6H14O6，分子量182.17，其化学结构见图4。

图4 化合物3的化学结构Fig.4 Chemical structures of compound 3

核磁共振波谱分析数据如下。

1）1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）的化学位移（δ）：3.36（2H，m，2，5-CH），3.49（2H，m，3，4-CH），3.64（4H，m，l，6-CH2），4.18（2H，d，3，4-OH），4.29 （2H，t，2，5-OH），4.42（2H，d，1，6-OH）。

2）13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）的化学位移 （δ）：64.3（C-1，6），70.0（C-2，5），71.8（C-3，4）。

根据GOP-Z-W-1的碳谱、氢谱数据，与参考文献[6]报道的谱图数据基本吻合，由此确定化合物3水相GOP-Z-W-1为D-半乳糖醇。

2.4.4 腺苷

化合物 4（GOP-Z-W-18） 为腺苷 （Adenosine），又称9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，白色或类白色结晶性粉末，化学式为C10H13N5O4，其化学结构见图5。

图5 化合物4的化学结构Fig.5 Chemical structures of compound 4

化合物4的核磁共振波谱分析数据如下。

1）1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）的化学位移（δ）：8.35 （1H，s，H-8），8.13 （1H，s，H-2），5.88（1H，d，J=6.4 Hz，H-1′），4.62（1H，d，J=6.0 Hz，H-2′），4.14 （1H，dd，J=2.8 Hz，J=4.8 Hz，H-3′），3.96 （1H，dd，J=12.8 Hz，J=26.4 Hz），3.68 （1H，dd，J=13.6 Hz，J=28.4 Hz，H-5′a），3.56 （1H，dd，J=3.6 Hz，J=7.9 Hz，H-5′b）。

2）13C-NMR（150 MНz，DМSО-d6）的化学位移 （δ）：156.7（С-6），152.9（С-2），149.6（C-4），140.4 （C-8），119.8 （C-5），88.4 （C-1′），86.4（C-4′），73.9（C-2′），71.1（C-3′），62.1（C-5′）。

根据GOP-Z-W-18的碳谱、氢谱数据，与参考文献[7]报道的谱图数据基本吻合，由此确定化合物4水相GOP-Z-W-18为腺苷。

2.4.5 吲哚-3-羧酸甲酯

化合物5为吲哚-3-羧酸甲酯（indole-3-carboxylate methyl ester），又名3-吲哚甲酸甲酯，白色结晶（甲醇），化学式为C10H9NO2，分子量175.184，其化学结构见图6。

图6 化合物5的化学结构Fig.6 Chemical structures of compound 5

核磁共振波谱分析数据如下。

1）1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）的化学位移（δ）：11.97（1H，brs，1-NH），8.07（1H，s，H-2），7.99（1H，d，J=6.9 Hz，H-7），7.48（1H，d，J=6.9 Hz，H-4），7.19 （2H，m，H-5，6）。

2）13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）的化学位移 （δ）：165.2（C=O），136.8（C-2），132.9（C-8），126.1 （C-9），122.8 （C-4），121.1 （C-6），120.87（C-5），112.8（C-7），106.8（C-3），51.1（-OCH3）。

根据化合物5的碳谱、氢谱数据，与参考文献[8]报道的谱图数据基本吻合，由此确定化合物5为吲哚-3-羧酸甲酯。

3 结论与讨论

紫陀螺菌为单生或丛生，菌肉淡紫色，子实体表呈紫色，长椭圆形[9]。其生长环境潮湿，光线阴暗，常生长在青冈栎等附近[10]。三峡地区山高林茂，地形复杂，气候温和适宜，是紫陀螺菌良好的生长地[11]。紫陀螺菌的生长速度慢、周期长，需要适宜的环境才能大规模培养优质菌种。此次在三峡地区调查其生长环境及分布，为以后紫陀螺菌的人工培养及开发利用提供方向，对提高珍稀野生食用菌产量、品质及保护真菌资源具有重要意义。紫陀螺菌含有蛋白质、维生素、微量元素等多种营养物质[12]，可充分利用其食用价值，提高三峡地区农民的经济收入。国内外对紫陀螺菌化学成分的研究较少，作者对紫陀螺菌的化学成分进行深入研究，得到化合物邻苯二甲酸-双（2’-乙基庚基） 酯、邻苯二甲酸-二（2-乙基己基） 酯、D-半乳糖醇、腺苷、吲哚-3-羧酸甲酯。紫陀螺菌含有的化学成分中含有丰富的药理活性[13]，加大对其化学成分的研究，提高提取工艺的精简性，为开发药理性保健品及研制出新的抗癌抑菌药物提供了重要依据。