一株野生美味扇菇菌株的驯化栽培及成分测定*

邱田美，王洪涛，于亚宁，徐丽丽，陆秀华

（青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室，山东 青岛 266109）

美味扇菇（Panellus edulis） 隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲 （Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 侧耳科 （Pleurotaceae） 扇菇属 （Panellus）[1]，又名亚侧耳、元蘑、冬蘑、黄蘑、冻蘑，广泛分布于中国东北、日本北部、美国和俄罗斯远东等地区[2-3]。美味扇菇肉质嫩滑，味道鲜美，具有很高的营养价值和很好的保健功能[4]，如防止动脉硬化、提高免疫力、抑制肿瘤增殖[5-6]。美味扇菇中还含有较高的麦角硫因，具有多种抗氧化和细胞保护作用[7]，能够保护机体抵御氧化性压力带来的损伤，可降低神经变性疾病的发生率[8]，是一种可以药食兼用的菌类。由于美味扇菇菌丝体生长缓慢，限制了其工厂化栽培生产以及在食品等其他方面的应用。

以野生美味扇菇为试验对象，优化其菌丝体生长条件，旨在获得生长速度快、菌丝洁白、稠密的菌丝体，为美味扇菇的工厂化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

野生美味扇菇1509菌株，青岛农业大学农业应用重点实验室保存。

1.1.2 基础培养基

基础培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨 2.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、CaCl20.5 g、VB110 mg、琼脂20.0 g，pH自然，蒸馏水定容至1 000 mL[9]。

1.1.3 主要仪器

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LDZF-75L立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器材厂；DPX-9052B-1电热恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司；L-890003030901氨基酸分析仪，株式会社日立制作所；542403061701离心机，德国艾本德股份公司；OCEDB-02五段金属浴，天根生化科技有限公司；QuantStudio503030973荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；打孔器、电子天平等。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

试验菌株参照《大型真菌图鉴》[10]，根据子实体的形状、大小、颜色等宏观特征进行初步鉴定，再根据菌丝等微观特征，进行传统形态学鉴定。

1.2.2 分子鉴定

采用Omega真菌DNA抽提试剂盒提取DNA，采用引物 ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’）和 ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’） 进 行PCR扩增[11]，得到的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳观察到有明亮条带后送公司测序。

1.2.3 单因素试验

在无菌条件下活化菌株，转入不同碳源、氮源和无机盐培养基中，25℃黑暗条件下培养，采用十字交叉法测量菌落直径，计算平均生长速率[12]。

碳源筛选以基础培养基为主，碳氮比30∶1为基础，碳源分别为葡萄糖20.0 g·L-1、甘露糖20.0 g·L-1、果糖 20.0 g·L-1、麦芽糖 13.4 g·L-1、蔗糖 13.4 g·L-1、乳糖13.4 g·L-1、可溶性淀粉18 g·L-1和空白对照8个处理，每个处理设3个重复。

氮源筛选以基础培养基为主，氮源分别为蛋白胨 2.0 g·L-1、酵母粉 2.7 g·L-1、尿素 5.8 g·L-1、硝酸铵7.6 g·L-1和空白对照5个处理，每个处理设3个重复。

无机盐筛选以基础培养基为主，分别设空白对照，MgSO4、KH2PO4、CaCl2各 1.0 g·L-1和 3 种无机盐共添加1.0 g·L-1共5个处理，每个处理设3个重复。

1.2.4 正交试验

考虑到碳源、氮源和无机盐之间的交互作用对菌丝体生长的影响，根据单因素实验结果，以筛选出最优的碳源、氮源和无机盐做三因素三水平正交试验，以菌丝平均生长速率为标准，从而筛选出三者之间的最佳因素水平搭配。

1.3 菌株1509子实体中营养成分测定

1.3.1 粗多糖含量的测定

按照参考文献[13]中苯酚-硫酸法测定多糖含量，按照DB37/T 3122-2018槐花多糖提取工艺及其生物活性评价技术规程[14]绘制葡萄糖标准曲线，根据标准曲线计算出多糖含量。

1.3.2 粗蛋白含量的测定

子实体粗蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[15]，A045-2蛋白定量测试盒购于南京建成生物工程研究所。按说明书步骤检测并计算子实体中粗蛋白含量。

1.3.3 钙、铁、VC、VE含量的测定

为测定菌株1509子实体中钙、铁、VC、VE的含量，参考GB 5009.90-2016食品中铁的测定[16]测定1509子实体中铁含量；参考GB 5009.92-2016食品中钙的测定[17]测定子实体中钙的含量；参考GB 5009.86-2016食品中抗坏血酸的测定[18]测定子实体VC含量，参考GB 1886.233-2016食品添加剂维生素E[19]测定子实体VE含量。

1.3.4 氨基酸含量分析

采用日立8900高速氨基酸分析仪，参考GB 5009.124-2016食品中氨基酸的测定[20]标准分析测定菌株1509子实体中的氨基酸成分。

2 结果与分析

2.1 野生菌株1509形态及其菌丝体ITS测序分析

2.1.1 野生菌株1509形态

野生菌株1509的形态特征见图1。

图1 1509野生菌株Fig.1 Wild strain of 1509

如图1所示，1509野生菌株菌盖直径在10 cm左右，呈半圆形，菌盖为黄褐色，且有黏液，有短细绒毛。菌盖边缘内卷，菌肉较厚，颜色为淡黄色。菌柄较短。

2.1.2 1509菌丝体ITS测序分析

菌株1509菌丝体的ITS序列扩增电泳图见图2。

图2 野生菌株ITS序列扩增电泳图Fig.2 ITS sequence amplification electrophoresis of wild strains

由图2可知，野生菌株1509通过ITS1和ITS4引物扩增后的碱基数约为750 bp。通过NCBI中的BLAST进行测序比对发现，菌株1509与美味扇菇有98.98%的相似性。

2.2 培养基筛选结果

2.2.1 单因素筛选结果

扇菇菌株1509在7种不同碳源培养15 d后，菌丝生长速率见图3。

图3 菌株1509在不同碳源下的菌丝平均生长速率Fig.3 The average growth rate of mycelium of strain 1509 under different carbon sources

由图3所示，可以看出在不同碳源条件下，菌丝生长速率有所差异。扇菇菌株1509以果糖为碳源时，菌丝稠密、洁白，菌丝边缘生长整齐；以葡萄糖为碳源时菌丝生长速率较快。因此菌株1509最适碳源为果糖，其次为葡萄糖。

扇菇菌株1509在4种不同氮源中培养15 d后，菌丝的生长速率统计见图4。

图4 菌株1509在不同氮源下的菌丝平均生长速率Fig.4 The average growth rate of mycelium of strain 1509 under different nitrogen sources

由图4可知，在不同氮源条件下，菌株1509菌丝生长速率有所差异。扇菇菌株1509在以蛋白胨为氮源时，菌丝稠密、洁白，菌丝边缘生长整齐；以硝酸铵为氮源时生长速率较快，菌丝洁白；尿素最不适宜培养菌株1509。因此菌株1509的最适氮源为蛋白胨。

扇菇菌株1509在3种不同无机盐中培养15 d后，菌丝的生长速率统计见图5。

图5 1509不同无机盐下菌丝平均生长速率Fig.5 The average growth rate of mycelium of strain 1509 under different inorganic salts

由图5可知，在不同无机盐条件下，菌株1509菌丝生长速率有所差异。菌株1509在以硫酸镁为无机盐时，菌丝稠密、菌丝边缘生长相对整齐。综上所述菌株1509最适无机盐为硫酸镁。

2.2.2 正交试验结果

以筛选出最优的碳源、氮源和无机盐设计三因素三水平正交试验，因素水平搭配见表1。

表1 正交试验因素与水平Tab.1 Orthogonal test factors and level

扇菇菌株1509的培养基优化正交试验结果见表2。

表2 美味扇菇培养基优化正交试验结果Tab.2 Optimize the orthogonal test results of Panellus edulis culture medium

由表2可知，美味扇菇1509菌丝体各因素最佳水平有所差异，最佳配比为A2B2C3，即果糖20 g·L-1，蛋白胨 2 g·L-1，MgSO40.75 g·L-1。此时菌丝生长最快，菌丝稠密、洁白，菌丝边缘生长相对整齐。根据碳氮比计算公式[21]，计算得碳氮比为31.57。极差分析表明，影响扇菇菌株1509菌丝生长速率的因素排序为A>C>B，即果糖>MgSO4>蛋白胨。

2.3 栽培出菇

根据培养基优化结果，配置最优培养基用于培养1509菌丝，按标准制作野生扇菇菌株1509的菌种和菌包，在温度条件为15℃～20℃，空气相对湿度为85～90%的大棚中栽培出菇，其子实体形态见图6。

图6 实验室人工栽培出菇图Fig.6 Results of artificial cultivation mushrooms in the laboratory

由图6可知，菌株1509菌盖形状为半圆形、肾形和扇形，菌盖直径为5 cm～10 cm。菌盖黄褐色，表面有绒毛，菌肉为淡黄色，厚而致密，菌褶为淡黄色，衍生，稍密。菌柄较短，内部为实心。经过驯化后的扇菇菌株1509出菇形态与野生扇菇形态一致。

2.4 菌株1509子实体营养成分分析结果

扇菇菌株1509子实体的营养成分含量及对照肺形侧耳5271营养成分含量[22]统计见表3。

表3 菌株1509和5271子实体的营养成分含量的比较Tab.3 Comparison of nutrients content for strains 1509 and 5271 fruit bodies

由表3可知，1509菌株中钙含量达到133.96 mg·100-1g-1，是大部分牛奶含钙量的1.1倍～1.5倍，粗蛋白质含量32.91 mg·100-1g-1，VE含量可达16.72 mg·100-1g-1，远超肺形侧耳子实体中的含量。而多糖含量较低，是真正的高蛋白高钙食品。

2.5 1509氨基酸成分分析

选用L-890003030901氨基酸分析仪，采用盐酸水解法[23]测得了栽培出菇的扇菇1509子实体中的17种氨基含量，见表4。

表4 1509氨基酸成分含量Tab.4 1509 amino acid components content

由表4可知，扇菇1509菌株谷氨酸含量高达1.15%。谷氨酸为呈味氨基酸，因此可使美味扇菇1509味道更加鲜美，并且谷氨酸作为肠上皮细胞能源物质、生物活性前体物质和神经递质，对肠道健康和功能的发挥具有重要的作用[24]。亮氨酸含量仅次于谷氨酸和天门冬氨酸，亮氨酸能够改善由高脂高胆固醇膳食引起的肥胖和能量代谢紊乱[25]。氨基酸总量（TAA） 为8.17%，其中EAA含量为3.24%，NEAA含量为4.93%，根据1973年世界卫生组织和联合国粮农组织发布的蛋白质营养价值必需氨基酸模式理论，EAA/TAA含量在40%左右，EAA/NEAA含量在60%以上，此时认为该蛋白质为理想蛋白质[26]，更利于人体吸收。美味扇菇1509中EAA/TAA含量为39.65%，EAA/NEAA含量为65.72%，均符合世界卫生组织和联合国粮农组织提出的理想蛋白均衡值[27]。

3 讨论与结论

试验通过对野生菌株1509进行鉴定和对其菌丝体生长条件优化。经鉴定，野生菌株1509为美味扇菇。单因素筛选其最适碳源为果糖，平均生长速率均高于其他试验组，并且果糖培养条件下菌丝洁白、稠密；最适氮源为蛋白胨，最适无机盐为MgSO4。进一步正交试验表明美味扇菇1509最适固体培养基配方为：果糖 20 g·L-1、蛋白胨 2 g·L-1、MgSO40.75 g·L-1、CaCl20.5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、VB110 mg·L-1、琼脂20 g·L-1。人工培养获得了美味扇菇1509的新鲜子实体，并测定了美味扇菇1509子实体的常规营养成分和氨基酸含量，可知其营养价值较高，风味佳，粗蛋白和钙含量尤其突出。美味扇菇1509中维生素E含量比常见的肺形侧耳要高，可满足每人每日所需VE。氨基酸比例均衡，EAA/TAA和EAA/NEAA含量均达到了人体吸收的理想蛋白均衡值。