利于高地芽孢杆菌YC-9生长和芽孢形成的碳源筛选

马聪聪， 罗泽华， 蔡斌， 刘好宝*， 王云山， 马锐， 顾金刚*

（1.中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海口 570105；2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；3.中国科学院过程工程研究所，北京 100190）

高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)多分布于土壤，产淀粉酶和碱性蛋白酶[1]。在生长发育后期，芽孢杆菌的细胞质高度脱水可形成圆形或椭圆形的休眠体，即芽孢[2]。芽孢具有耐高温、耐高压、耐干燥、耐酸碱、耐有机溶剂等特性，广泛应用于医药、种植业、畜牧业等领域[3-4]。产芽孢不稳定、芽孢率低、芽孢量少等会影响芽孢杆菌的应用[5]。碳氮源是影响芽孢杆菌形成芽孢的重要因子[6]。芽孢的研究主要集中于芽孢的形成机制和营养因素促进芽孢产生的影响等方面[5-6]，其中，芽孢杆菌芽孢产生的优化主要有碳氮源、无机盐等营养因子以及接种量等培养条件的优化，且都集中在摇瓶水平，优化方法较单一、传统。本研究采用Biolog PM 表型分析系统和全自动生长曲线仪，实现菌株发酵的高通量和自动化，利用Biolog 系统GenⅢ鉴定板的碳源底物和全自动生长曲线空白板配制不同碳源培养基，实现对碳源的快速筛选和产芽孢能力的测定，并利用2 种设备的专业软件对数据进行处理和分析。利用这2 种仪器研究高地芽孢杆菌YC-9 在不同碳源条件下的产芽孢量和生长周期，以获得提高YC-9 的产芽孢量和产芽孢率的最佳碳源。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

供试菌株：高地芽孢杆菌菌株Bacillus altitudinisYC-9，由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业农村部农业微生物资源收集保藏重点实验室分离鉴定。

LB 培养基(1L)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，pH 7.0，1×105Pa灭菌30 min。

液体培养基(1L)：碳源 5.0 g，(NH4)2SO43.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0，1×105Pa 灭菌30 min。

碳源筛选培养基(1L)：利于菌体生长的碳源5.0 g，利于产孢的碳源5.0 g，(NH4)2SO43.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0，1×105Pa灭菌30 min。

发酵培养基 (1L)：碳源5.0 g，蛋白胨3.0 g，酵母浸粉 3.0 g，葡萄糖 1.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 7.0～7.2，1×105Pa灭菌30 min。

1.2 Biolog PM 表型鉴定

菌株YC-9 经LB 培养基活化后，用无菌棉签蘸取少量菌体接种于Biolog GenⅢ接种液中，用浊度计将接种液细胞含量调节为98%T（T表示菌悬液浊度），制成孢子悬浮液备用。将100 μL 制备好的孢子悬浮液分别加入GenⅢ的微孔后放入OmniLog 培养箱中，37 ℃条件下分别培养12、24、36 h[7]。以Biolog 软件完成数据的格式转换与处理，以荧光动力曲线下的高度(height)为参数进行数据分析，选3 次试验的平均高度进行计算。培养结束后收集2 μL 培养液，涂片风干，番红染色，镜检观察载玻片确定芽孢数量[8]。每处理设置3个重复。

1.3 单一碳源筛选

以无菌水培养基为对照，将Biolog PM 确定的最适碳源分别作为液体培养基的碳源，用全自动生长曲线仪监测菌株YC-9的生长曲线。用无菌牙签将菌株 YC-9 接种于 LB 培养液，37 ℃、200 r·min-1培养12 h后制成接种液。接种液和液体培养基以1∶7的比例混匀，在生长曲线仪100孔培养板中，每个孔加入接种液300 μL，放入全自动生长曲线仪中，每种碳源设置3个重复，即培养板上的3个孔，37 ℃、200 r·min-1培养48 h，测定芽孢量。

1.4 碳源组合筛选

以利于菌体生长的碳源和利于产芽孢的碳源进行组合制备碳源筛选培养基，进一步筛选碳源。种子液制备同1.3。种子液以5%的比例接种于装液量为50 mL 的锥形瓶中（容积250 mL），37 ℃、200 r·min-1培养。每 4 h 测定 1 次 pH 和 OD600值；48 h 时结束发酵，采用平板菌落计数法检测细菌总数；80 ℃水浴加热10 min 处理发酵液，稀释涂布平板法检测芽孢量[9]。每种碳源组合设置3个重复。

1.5 摇瓶条件下碳源筛选

在摇瓶条件下，分析不同碳源及碳源添加对菌株YC-9 生长和产孢的影响。以常见碳源葡萄糖为对照组，葡萄糖+筛选碳源为试验组制备发酵培养基，种子液以5%的比例接种至含50 mL组合培养基的锥形瓶中（容积250 mL），培养方法及菌体数、芽孢数、pH和OD600值检测同1.4。

1.6 数据处理

采用Biolog D5E_OKA_data.exe 软件收集各菌株的代谢表型数据并进行格式转换，使用Biolog OL_FM_1.2.exe 软件进行数据分析，选3 次试验平均峰高度进行计算。分别采用GraphPad Prism 8和Origin 9做曲线图和柱形图。

2 结果与分析

2.1 Biolog碳源利用情况和产芽孢分析

GenⅢ板含有71 种供试碳源，菌株YC-9 利用各种碳源生长和产孢的情况如表1 所示。利于菌株YC-9 生长和产孢的碳源有4 种，分别为肌醇、果胶、D-果糖-6-磷酸和半乳糖醛酸。产芽孢较多但生长较差的碳源有14种，其中糖类居多，其次是酸类，包括D-松二糖、水苏糖、D-棉子糖、D-乳糖、蜜二糖、N-乙酰神经氨酸、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨醇、α-羟基丁酸、β-羟基-D,L-丁酸、L-丙氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸。产芽孢量低但利于生长的碳源有16种，包括D-海藻糖、D-纤维二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、水杨苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油、D-天冬氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、奎宁酸、L-苹果酸、γ-氨基丁酸和乙酰乙酸。

表1 高地芽孢杆菌菌株YC-9利用GenⅢ板上不同碳源的生长和产孢情况Table 1 Growth and spore yields of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources on GenⅢplate

表1 高地芽孢杆菌菌株YC-9利用GenⅢ板上不同碳源的生长和产孢情况Table 1 Growth and spore yields of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources on GenⅢplate 续表Continued

以下选择8 种生产上较为常用、产芽孢量低但利于生长的碳源进行后续研究，分别为D-海藻糖、D-纤维二糖、水杨苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、甘油、L-苹果酸。

2.2 不同碳源和碳源组合对菌株YC-9 生长的影响

基于Biolog PM 营养表型分析结果，采用全自动生长仪分析8种单一碳源培养条件下菌株YC-9的生长状况和产孢能力。综合图1 和表2 结果分析，该菌以水杨苷为底物时可以快速生长，培养16 h 的生物量高于其他碳源，但芽孢率在24、36、48 h 时相比于其他碳源都较低；α-D-葡萄糖为底物时，菌体生长呈先上升后下降的趋势，培养16 h时菌体密度最大，在36和48 h 时芽孢率较高。以L-苹果酸为底物时，培养24 h 时菌体密度最大，24～32 h 处于平稳阶段，36 和 48 h 时芽孢率为93%。结合Biolog PM 表型分析结果，水杨苷为芽孢产量低、菌体生长好的最佳碳源。

表2 菌株YC-9在各碳源中的芽孢率Table 2 Spore rate of strain YC-9 by using different carbon sources

图1 高地芽孢杆菌菌株YC-9在不同碳源条件下的生长曲线Fig.1 Growth curves of Bacillus altitudinis YC-9 by using different carbon sources

基于Biolog PM 表型分析结果和单一碳源筛选结果，选择7 种芽孢产量高但菌体生长差的碳源与水杨苷组合培养菌株YC-9。以单一碳源水杨苷为对照，菌株YC-9 水杨苷分别与L-鼠李糖、D-山梨醇和D-棉子糖为组合的生长曲线基本一致，细胞量上升较缓慢，培养16 h 达最大菌密度（OD600约为0.46），之后呈平稳趋势；其他3种碳源组合（对照水杨苷、水杨苷+肌醇及水杨苷+半乳糖醛酸组合）上升较快，最大OD600值约在0.8～1.0；其中水杨苷+水苏糖组合在24 h 后呈缓慢下降趋势，48 h时OD600值下降至0.7左右（图2）。

以葡萄糖替代水杨苷，分别与D-山梨醇和肌苷组合成双碳源。与单一碳源葡萄糖相比，菌株YC-9 的生长曲线变化趋势大致相同，其中葡萄糖+D-山梨醇的碳源组合相对不利于菌体生长，而葡萄糖+肌苷的碳源组合最利于菌体生长，培养12 h达最大菌密度（图2）。

图2 菌株YC-9在不同各碳源组合条件下的生长曲线Fig.2 Growth curves of Bacillus altitudinis YC-9 using different dual carbon sources

2.3 不同碳源组合对菌株YC-9 发酵液pH 的影响

在摇瓶水平上监测不同碳源组合培养下菌株YC-9 发酵液的pH 变化，以水杨苷与其他碳源组合培养菌株YC-9时，其发酵液pH 都呈下降趋势；其中水杨苷+肌醇的组合碳源的发酵液pH 下降更快，12 h 时低至pH 5.3左右（图3）。

以常见的工业发酵碳源葡萄糖替代水杨苷时，菌株YC-9 的发酵液pH 变化趋势呈先下降再上升，pH 由中性变到碱性，高于9.0。其中葡萄糖+D-山梨醇组合的发酵液pH 较其他2个组合高，而葡萄糖+肌苷组合的发酵液pH 相对偏小（图3）。

图3 不同碳源组合下菌株YC-9发酵pH Fig.3 Fermentation pH of strain YC-9 under different carbon source combinations

2.4 不同碳源对菌株YC-9生长和产孢的影响

在全自动生长曲线仪上研究不同单一碳源培养下菌株YC-9发酵液的产芽孢量变化（表2）。菌株YC-9在24 h时以D-海藻糖和甘油为碳源时，芽孢率差异不显著，但和其他碳源相比芽孢率显著提高；在36和48 h时以α-D-葡萄糖和L-苹果酸为碳源时差异不明显，但产芽孢率和其他碳源相比显著提高，以L-苹果酸为碳源时芽孢率均高达93%。结果表明，菌株YC-9在培养36和48 h以α-D-葡萄糖和L-苹果酸为碳源可明显提高芽孢率。

同时在摇瓶水平上监测不同组合碳源培养下菌株YC-9的48 h内的生长和产孢情况（图4）。菌株YC-9 在所有的待测培养基中的生长和产孢趋势一致，培养12 h 时菌体数较高，在12 和24 h 时芽孢数较高。在菌体生长方面，以水杨苷+水苏糖和水杨苷+L-鼠李糖组合为碳源时，菌株YC-9的菌体数在4个时间点和只添加水杨苷的对照组菌体数相比均差异显著（P＜0.05）；在产芽孢方面，水杨苷+肌醇的组合碳源和对照组差异不大，水杨苷+D-棉子糖和水杨苷+L-鼠李糖的组合碳源与对照相比芽孢数有显著差异，但芽孢率不高；水杨苷+肌苷和水杨苷+D-山梨醇的组合碳源与对照相比芽孢数显著提高，培养24 h 时芽孢率分别为35.67%和23.94%。结果表明，高地芽孢杆菌YC-9 在摇瓶水平上的产孢结果与Biolog PM 表型分析结果一致；水杨苷基础上添加D-棉子糖、L-鼠李糖、肌苷和D-山梨醇与对照相比芽孢数差异显著，其中添加肌苷和D-山梨醇芽孢率相对较高。

图4 不同碳源组合下菌株YC-9生长和产孢情况Fig.4 The growth and sporulation of Bacillus altitudinis YC-9 under different carbon sources

同时在摇瓶水平上监测以葡萄糖替代水杨苷与肌苷或D-山梨醇组合培养菌株YC-9 的生长和产孢情况（图5）。在菌体生长方面，该菌株在葡萄糖+肌苷的组合碳源与只添加葡萄糖的对照相比菌体数显著提高（48 h 时除外），在12 h 时菌体数高达 3.00×108cfu·mL-1；在产芽孢方面，葡萄糖+D-山梨醇的碳源组合在12和36 h与对照组相比芽孢数显著提高，36 h 时芽孢率达56.64%。葡萄糖+肌苷在24 和48 h 与对照组相比显著提高，24 h 芽孢总量为 3.90×107cfu·mL-1，芽孢率高达60.47%，其他时间点变化不大。结果表明，菌株YC-9以葡萄糖+肌苷为碳源时，芽孢数增长显著，且芽孢率是仅以葡萄糖为碳源时的2 倍，并且菌株YC-9 的最佳生长时期为12 h，最佳产芽孢时间为24～36 h。

图5 不同碳源组合下菌株YC-9生长和产孢情况Fig.5 Growth and sporulation of Bacillus altitudinis YC-9 under different carbon sources

3 讨论

芽孢是芽孢杆菌在一定培养条件或生长阶段下形成的抗逆性很强的休眠体[10]，受碳氮源、温度、pH 等影响[11-12]，其中在芽孢形成过程中，碳源是影响芽孢形成的主要因素[13]。徐世荣等[5]研究发现，通过营养限量可诱导B.subtilis芽孢的形成，根据不同微生物的需要，选择适宜的碳源，才能实现菌体或芽孢数量的提高。本研究表明，高地芽孢杆菌菌株YC-9对碳源的代谢能力较好，以水杨苷为碳源时产芽孢率较低，以L-苹果酸和α-D-葡萄糖为碳源时产孢率显著提高。水杨苷对菌株YC-9 产芽孢可能有一定的抑制作用，但对菌体生长有促进效果。α-葡萄糖不仅有利于菌株YC-9菌体生长，也有利于产孢。菌株YC-9 以水杨苷+肌苷和水杨苷+D-山梨醇为组合碳源培养时不利于菌体生长，但显著提高芽孢产生。Osadchaya等[14]研究表明，通过增加产孢培养基的碳源组成，B.subtilis的细胞生物和芽孢产量较单一碳源时有了显著提高；当葡萄糖和木糖组成为1∶1 时，芽孢产量是葡萄糖和木糖为单一碳源时的1.43～1.90倍。本研究以葡萄糖替代水杨苷后，菌株YC-9在葡萄糖+肌苷的碳源组合中产芽孢数较单一葡萄糖提高，且产芽孢率高。

不同的碳源与菌株YC-9的发酵液pH 息息相关。当培养基以葡萄糖为碳源时，发酵液pH在后期都呈弱碱性，此时产芽孢率较高。Khardziani等[15]研究枯草芽孢杆菌KATMIRA 1933 时也发现，培养基的pH接近中性有利于芽孢杆菌的生长和营养细胞的最大积累，酸化会抑制芽孢杆菌的生长和产孢，而微碱性有利于产孢。本研究确定了高地芽孢杆菌菌株YC-9 的最佳生长和产孢碳源及发酵时间，初步揭示了高产孢的营养机制，为该菌株的工业生产发酵提供了重要的参数。