促红细胞生成素对大鼠磨牙牙髓血运重建术后SDF-1和VEGF表达水平及疼痛的影响

王 芹, 李立恒, 王钟华, 杨永超, 冯建梅, 胥爱文, 安 峰, 申叶春

(河北北方学院附属第一医院口腔科, 河北 张家口 075000)

牙髓属于牙齿中唯一的疏松结缔组织,发挥感觉及外界防御作用,当牙齿损伤导致牙髓感染或坏死,降低牙髓活力及牙齿寿命[1]。牙齿损伤后血运减弱,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达降低,VEGF具有促进牙髓组织血管形成,提高牙髓损伤修复能力[2]。基质细胞衍生因子1(SDF-1)属于趋化因子之一,在神经、血管及软骨等部分发挥修复及再生作用[3]。在牙齿脱位后牙髓无坏死时保持牙髓活力,及时进行牙髓血运重建至关重要。目前随着分子生物学的发展,在牙齿血运重建过程中认为促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对于牙齿具有保护作用[4]。相关学者证实EPO能够通过增加VEGF水平,有助于拔牙大鼠血运重建[5],本文以EPO对磨牙牙髓SDF-1因子的水平及炎性因子水平作为创新点进行实验研究,为牙髓损伤的修复再生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验大鼠:48只SPF级SD大鼠来自河北北方学院附属第一医院,200g±25g,饲养于动物房内,每个笼子有4只大鼠,实验期间均自由饮水及摄食,喂养一周后进行实验,动物许可证号：SYXK(冀)2018-0016。

1.2主要试剂与仪器:EPO(西宝生物科技)；庆大霉素及生理盐水(辽宁民康药业)；4%多聚甲醛(江苏世泰实验器材)；SDF-1抗体(亚科因(武汉)生物)；VEGF及GAPDH抗体(罗氏公司)；HE试剂盒(康迪斯化工(湖北))；BCA蛋白试剂盒(天津金克隆生物技术)；DL-S OOOB低温离心机(上海安亭)；光学显微镜(舜宇光学科技(集团)。

1.3大鼠无髓根管模型建立:参考文献[8],选择牙齿完好无病症的大鼠,选择双侧下颌第一磨牙作为实验牙齿,将实验牙齿近中及远中根管作为实验根管,按照50mg/kg腹腔注射1%的戊巴比妥钠麻醉,开髓,疏通根管后,使用NaClO溶液浸泡根管溶解牙髓并用生理盐水冲洗；依次使用10#、15#、20#H锉拔髓,1.5%NaClO溶液和17%EDTA溶液交替冲洗,直至根管内无明显渗出,干燥根管后使用氢氧化钙糊剂进行根管封药,MTA封闭根管口,流动树脂充填窝洞。

1.4分组及干预方法:将48只大鼠分为正常组、模型组、250IUEPO组及500IUEPO组,均12只,除正常组外,其余大鼠均进行无髓根管模型建立及血运重建,EPO-A组及EPO-B组均腹腔注射250IU/Kg的EPO及500IU/Kg的EPO,其余大鼠均腹腔注射相同体积的0.9%的生理盐水。连续注射14d,每日一次。

1.5酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎性因子:各组大鼠干预14d后,次日清晨空腹状态下取尾部静脉血1mL,放入抗凝离心管中分离低速离心机按照3000r/min运转20min,保留血清,采用ELISA法检测检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-1β(IL-1β)水平。

1.6组织提取:各组大鼠干预14d后,麻醉处死大鼠(1%戊巴比妥钠),保留下颌骨放入10%的甲醛溶液中,固定过夜,自来水冲洗,浸泡于14%的EDTA溶液中脱钙,逐层脱水后石蜡包埋后4μm切片后村村备用。

1.7HE染色观察根管组织病理形态:各组大鼠组织切片放入37℃复温15min,二苯甲脱蜡后按照100%-95%-85%及75%乙醇进行逐层脱水,苏木精染色10min,1%盐酸酒精处理10s,放入饱和碳酸锂中返蓝,加入伊红染色液染色10s,再次逐层脱水后中性树脂封片后显微镜观察组织形态。

1.8免疫印迹检测根管组织SDF-1及VEGF蛋白表达:根管组织采用1%裂解液,离心后保留上清液采用BCA检测蛋白,加入样品后,进行SDS-PAGE电泳,转入聚偏二氟乙烯膜,封闭60min,加入SDF-1及VEGF (1∶500),内参为GAPDH(1∶500),加入辣根氧化酶2抗(1∶2000),摇匀,采用TBST冲洗膜,最后ECI话化学发光显色,试验重复3次取平均值。

1.9人牙髓干细胞培养、分组及处理:将购自北京泽平公司的人牙髓干细胞放入37℃、5%CO2饱和湿度下培养,生长至80%～90%时进行传代,放入15mL的离心管中1000r/min,5min后,弃去上清液放入培养基中2～3d传代。将人牙髓干细胞分为正常组、EPO组、SDF-1组及VEGF组,EPO组人牙髓干细胞中加入10U/mL的EPO共培养,SDF-1组及VEGF组则分别加入100μg/L的SDF-1及10ng/mL的VEGF培养,正常组为人牙髓干细胞添加PBS培养液。

1.10CCK-8检测各组人牙髓干细胞增殖:取对数生长的第3代人人牙髓干细胞接种到96孔板中,数量5×108·L-1,没孔体积200μL,在37℃饱和湿度下培养24h、36h和72h,均加入5g/L CCK-8试剂,继续培养2h,全自动酶标仪450nm下检测吸光度,计算增值率。公式：药物处理组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%,取3次平均值。

1.11qRT-PCR检测各组人牙髓干细胞细胞SDF-1及VEGF mRNA相对表达:提取各组培养后的人牙髓干细胞细胞,数量为1×105个/孔,去培养基后,PBS冲洗,加入200μL氯仿,离心后加入乙醇,沉淀后进行7000转高速离心,提取RNA。将RNA逆转录为DNA,以β-actin为内参,反应条件：98℃6min,98℃28S,75℃30S,80℃4min,总计55个循环,见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1各组大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较:与和正常组相比,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05),与模型组相比,EPO-A组及EPO-B组大鼠血清中炎性指标均降低(P<0.05),且EPO-B组血清中炎性指标低于EPO-A组,组间比较有差异(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠血清中TNF-α IL-6及IL-1β水平比较

2.2HE观察各组大鼠根管组织形态:正常组：大鼠牙根管组织有大量的梭形成纤维细胞分布,结缔组织紧致分布；模型组：根管内部分为不规则的矿化基质,未见血管形成,根尖内存在大量炎性细胞,并先根管内部延申并部分进步根管内。EPO-A组及EPO-B组根管内存在不规则矿化,在根尖1/3处可发现新生血管,有少量炎性细胞分布根尖周围。见图1。

图1 各组大鼠根管组织病理形态比较(200×)

表3 各组大鼠根管组织SDF-1及VEGF蛋白水平

2.3免疫印迹检测各组大鼠根管组织SDF-1及VEGF蛋白水平:模型组大鼠根管组织中SDF-1及VEGF蛋白表达水平低于正常组(P<0.05),EPO-A组及EPO-B组SDF-1及VEGF蛋白表达水平高于模型组(P<0.05),EPO-B组与EPO-A组比较差异显著(P<0.05),见表3、图2。

图2 各组大鼠根管组织SDF-1及VEGF蛋白电泳图

图3 光学检显微镜观察人牙髓细胞分化(A：100×,B：200×)

2.4人牙髓细胞分化实验:人牙髓细胞克隆至第二代时,倒置显微镜下观察细胞形态,镜下可见,细胞生长状况良好,呈梭形或星形,细胞间排列紧密,胞浆丰富,胞浆的突起互相连接,细胞核呈卵圆形,位于细胞中央,有明显的核仁。见图3。

2.5各组人牙髓细胞相对增殖率比较:EPO组、SDF-1组及VEGF组人牙髓细胞的在24h、48h及72h的相对增殖率均高于正常组(P<0.05),EPO组、SDF-1组及VEGF组24h、48h及72h相对增殖率比较无意义(P>0.05),组内不同时间比较,EPO组、SDF-1组及VEGF组均随着时间延长而相对增值率升高(P<0.05),见表4、图4。

表4 各组人牙髓细胞相对增殖率比较(%)

图4 各组人牙髓细胞相对增殖率比较

表5 各组人牙髓细胞中SDF-1及VEGF mRNA表达比较

2.6各组人牙髓细胞中SDF-1及VEGF mRNA表达比较:与正常组相比,EPO组、SDF-1组及VEGF组细胞中SDF-1及VEGF mRNA表达升高(P<0.05),EPO组、SDF-1组及VEGF组SDF-1及VEGF mRNA水平无意义(P>0.05),见表5,皮尔森相关系数分析结果显示：SDF-1mRNA与VEGF mRNA呈现正向相关性(r=0.576,P=0.003),见图5。

图5 各组人牙髓细胞中SDF-1及VEGF mRNA相关性分析

3 讨 论

牙髓血运重建术作为改善牙髓感染后坏死或根尖且未闭合的年轻恒牙的治疗方案,已经过大量动物及临床试验证实其能够为牙根生长及根管壁增厚提供理想治疗效果[5,6],但是在此过程中牙新生组织多为牙骨矿化物质,而非真正的牙髓组织,从而影响恢复效果。细胞因子在机体炎症反应表达异常,TNF-α、IL-6及IL-1β等细胞因子在牙髓损伤及坏死时表达升高,被认为是牙髓疾病重要炎性因子,主要原因与在牙齿损伤后激活巨噬细胞M1表达而分泌大量炎性因子,提高炎症反应。本文研究证实,大鼠牙髓进行血运重建后,大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β等表达升高,采用EPO腹腔注射后可降低炎性水平,说明EPO能够减少牙髓血运重建后的炎性表达而降低疼痛。EPO属于能够通过激活红系造血组细胞而通过加快红细胞生成应用于临床多种疾病的治疗,例如恶性肿瘤合并贫血等。近些年研究证实,EPO对骨生成也发挥重要作用。EPO能够通过降低细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞间粘附分子-1(VCAM-1)而抑制巨噬细胞表达[7]。Mahboubeh R[8]研究证实,在口腔黏膜炎中EPO能够同抑制TNF-α等炎性因子的表达而减少活性氧氧化应激,改善口腔炎症,缓解疼痛。本文与 Vajihe[9]研究相似。

本文对人牙髓细胞采用EPO、VEGF及SDF-1培养后发现EPO、VEGF及SDF-1均能够刺激人牙髓细胞增殖,说明EPO、VEGF及SDF-1能够作为牙髓再生修复因子而发挥牙髓修复,促进牙髓修复及血管再生作用。在人牙髓细胞中EPO能够调节神经节样细胞分化,主要是通过激活p38MAPK表达促进人牙髓细胞增殖。高糖环境中人牙髓细胞增殖受到抑制后,外源性上调EPO后可提高人牙髓细胞在高糖环境下的成骨能量,说明EPO能够提高牙髓细胞碱性磷酸酶活性,增加牙髓细胞增殖能力。VEGF在牙齿发育及牙髓损伤愈合修复方面具有重要作用,通过内皮细胞分化、促进血管再生,保护牙齿提高细胞繁育。在牙髓细胞损伤后VEGF短暂性表达上调发挥修复损伤作用。SDF-1能够抑制人牙髓细胞成牙本质分化,通过上调骨形态发生蛋白2(BMP2)表达而对人牙髓细胞发挥趋化效应而增加活性。也有研究表明EPO能够促进内皮细胞增殖,加强血管形成能力,从而抑制血管收缩,其主要通过调节磷酸化Janus激酶(JAK2)信号转导因子及转录活化因子(STAT3)的表达来提高VEGF水平,参与牙髓修复作用[10]。

综上所述：促红细胞生成素能够降低大鼠磨牙牙髓血运重建术后炎症水平,缓解疼痛,并通过提高SDF-1、VEGF表达促进血管新生,参与血运重建。