基于CN/IL-10信号途径探讨乌司他丁对神经性疼痛大鼠模型的镇痛效应及作用机制

黄钰媛, 韦雪梅, 郑育秀, 刘丽丽

(海南医学院第二附属医院麻醉科, 海南 海口 570311)

神经性疼痛(Neuropathic pain)是躯体感觉神经系统损害或功能障碍引起的疼痛,属于常见的慢性顽固性疼痛。由于神经性疼痛病因复杂,当前针对神经性疼痛的治疗药物有限,使得该疾病仍无法得到有效控制,对患者身体健康及生活质量产生持续性危害[1]。因此,探寻治疗神经性疼痛的有效药物和靶点,仍然是临床亟需解决的难题。相关研究表明[2],周围神经受损后,胶质细胞被激活,随后分泌的大量促炎介质引起的神经炎症反应是神经性疼痛发生、发展的重要因素。因此,抑制炎症反应可能成为神经性疼痛治疗的潜在途径。乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,在临床上被广泛用作消炎药。研究发现[3],UTI可抑制炎症介质的释放、降低过氧化物酶和氧自由基水平,从而发挥心、肝、肾等多脏器保护作用。同时,UTI还能够减轻脑损伤及神经功能损伤,具有神经保护作用[4]。但目前关于UTI作用于神经性疼痛的研究报道较少,因此,本研究建立慢性坐骨神经结扎(chronic constriction injury,CCI)大鼠模型,旨在探究UTI对神经性疼痛的镇痛效应及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物：SPF级雄性SD大鼠40只,体重220～250g。饲养环境室温为22～24℃,相对湿度45～55%,每日明暗交替各12h,标准饲料喂养,自由饮水、进食。本研究动物实验操作均按照国际疼痛研究协会和国家动物实验伦理委员会要求进行,严格遵循“3R”原则,实验中尽量减少动物痛苦与用量。

1.2实验试剂和仪器:UTI注射液(广东天普生化医药股份有限公司,国药准字H19990133)；他克莫司(FK506)(安斯泰来制药(中国)有限公司,注册证号H20020377)；水合氯醛、多聚甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(默沙克生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色法(HE)试剂盒、原位缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒、RIPA裂解液、二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；兔抗钙调神经磷酸酶(calcineurin,CN)抗体、兔抗白介素-10(interleukin-10,IL-10)抗体、兔抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(美国Abcam公司)；增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence,ECL)(上海时代生物科技有限公司)。JZ-BME-410C热痛刺激仪(北京九州晟欣科技有限公司)；Von-Frey纤维丝测痛仪(美国North Coast公司)；CM3050S切片机(德国徕卡)；LD-96A酶标仪(山东莱恩德智能科技有限公司)；CKX53光学显微镜、IXTI-12FL/PH荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；1658001型垂直电泳仪、1703930转膜仪(美国Bio-Rad公司)；FCM凝胶成像分析系统(美国protein simple公司)。

1.3实验方法

1.3.1实验分组和CCI大鼠模型制备:将40只大鼠适应性喂养7d后,随机分为假手术组(Sham组)、模型组(CCI组)、UTI组、UTI+FK506组,每组10只。CCI组、UTI组、UTI+FK506组大鼠根据参考文献[5]进行造模,将大鼠俯卧位固定于实验台,10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉,选取大鼠左后肢备皮、消毒,沿大鼠左外侧大腿皮肤切口,钝性分离大腿肌肉组织,使坐骨神经干完全暴露,在坐骨神经干上用4-0铬制羊肠线做4圈环形结扎,每圈间距约1mm,结扎强度以引起大腿肌肉或足趾轻度颤动反应为宜,复位坐骨神经,缝合皮肤,注射青霉素钠预防感染。术后24h内大鼠表现出明显的疼痛行为学变化,包括机械痛敏、热痛敏等,出现术侧爪内收同时后足轻度外翻和跛行等自发性疼痛表现和坐骨神经病理性损伤,即表示模型建立成功。Sham组大鼠同上述操作,只暴露坐骨神经干但不结扎。

1.3.2动物给药:造模后进行给药处理,UTI组大鼠腹腔注射UTI 10万U/kg,UTI+FK506组大鼠腹腔注射UTI 10万U/kg和2 mg/kg FK506, Sham组和CCI组大鼠分别腹腔注射等量生理盐水。各组动物均每天给药1次,连续给药7d。

1.3.3机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的测定:采用Up-Down法测定大鼠机械痛阈的行为学。将各组大鼠单独置于透明隔板隔开的金属网格笼中,大鼠适应环境30min,待大鼠活动基本消失后,利用不同级别压力系数的Von-Frey纤维丝测痛仪刺激大鼠足底中外侧,逐渐加压使刺激针弯曲呈90度,维持5s的刺激时间。若大鼠出现抬足或舔舐足底的行为,则记为阳性反应。连续刺激时,测量间隔时间为5min。分别检测各组大鼠术前1d、术后3、7、10、14d的MWT。

1.3.4热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的测定:将各组大鼠单独置于有机玻璃间隔的玻璃板(厚度2 mm)上,大鼠适应环境30 min,将热痛刺激仪置于玻璃板下方,并对准大鼠后爪掌面正中,启动刺激仪,当大鼠抬足或舔舐足底时,停止计时,仪器显示的时间即为为TWL。每只大鼠测定5次,每次间隔10min,取5次平均值。分别检测各组大鼠术前1d、术后3、7、10、14d的TWL。

1.3.5组织取材及处理:术后第14天疼痛指标测量结束后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,断颈处死,快速取出各组大鼠术侧坐骨神经,一部分坐骨神经标本固定于4%多聚甲醛中,一部分坐骨神经标本置于-80℃冰箱保存备用。

1.3.6HE染色法检测大鼠坐骨神经组织形态学变化:将保存于4%多聚甲醛中固定的大鼠坐骨神经组织标本常规石蜡包埋、切片,切片厚度为5μm,将各组大鼠坐骨神经切片用苏木精染液染色5min,蒸馏水洗去染色液,1%盐酸乙醇3s,蒸馏水洗涤后,用伊红染液染色2min,依次侵入70%、80%、90%、100%乙醇中脱水10s,然后用二甲苯透明5min,中性树胶封片,显微镜下观察拍照。

1.3.7ELISA法检测大鼠坐骨神经组织中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平:取-80℃冰箱保存备用的各组大鼠坐骨神经标本,加入生理盐水,在4℃条件下匀浆制成10%匀浆液,10000r/min离心10min,收集上清液,严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作,建立标准曲线,根据酶标仪上读取的样品值计算IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.3.8TUNEL法检测大鼠坐骨神经组织细胞凋亡情况:取各组大鼠坐骨神经组织石蜡切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5min,用吸水纸吸干多余液体,37℃下加入蛋白酶K工作液处理组织30min,PBS漂洗3次×5min,每个标本上滴加50μL TUNEL反应混合液,置入湿盒中,37℃避光反应60min,PBS漂洗3次×5min,滴加50μL Converter-POD转化剂,置入湿盒中,37℃避光反应30min,PBS洗涤3次×5min,DAPI染色液染色细胞核,室温避光反应10min；用DAB显色,苏木素复染,自来水冲洗反蓝,常规脱水透明,加适量抗荧光淬灭剂封片,倒置荧光显微镜下观察拍照,DAPI标记的正常细胞核呈蓝色,细胞核中红色颗粒为凋亡细胞,记录细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3.9Western blot法检测大鼠坐骨神经组织CN和IL-10蛋白表达水平:取-80℃冰箱保存备用的各组大鼠坐骨神经组织标本,用RIPA裂解液提取组织总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,蛋白样品水浴煮沸变性5min,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)电泳分离,湿法转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),将膜置于含5 %脱脂牛奶的封闭液中室温封闭2h,分别加入CN一抗(1∶500)、IL-10一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶1000),4℃孵育过夜,Tris盐酸缓冲液(tris buffered saline tween,TBST)洗膜3次×10min,加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000),37℃孵育1h,TBST洗涤3次×10min,加入ECL化学发光试剂显影,以β-actin为内参,采用凝胶成像系统仪分析目的蛋白表达水平。

2 结 果

2.1UTI对神经性疼痛大鼠MWT和TWL的影响:与Sham组相比,CCI组大鼠术后3、7、10、14d术侧MWT和TWL值明显降低(P<0.05)；与CCI组相比,UTI组大鼠术后3、7、10、14d术侧MWT和TWL值明显升高(P<0.05)；与UTI组比较,UTI+FK506组术后3、7、10、14d术侧MWT和TWL值明显降低(P<0.05)(见图1A和B)。

2.2UTI对神经性疼痛大鼠坐骨神经组织形态学的影响:HE染色结果显示,Sham组大鼠坐骨神经纤维结构完整、排列整齐、形态正常,无明显炎症反应；CCI组大鼠坐骨神经纤维结构紊乱、分布不均匀、神经纤维密度降低,呈收缩状或空泡状,炎性浸润及水肿明显；UTI组和UTI+FK506组大鼠坐骨神经组织形态学有一定改善,其中UTI组大鼠坐骨神经纤维结构较整齐、分布较均匀、神经纤维空泡样变性减少,密度增加,水肿面积明显减少,改善效果较UTI+FK506组更为显著(见图2)。

图1 UTI对神经性疼痛大鼠MWT和TWL的影响

图2 UTI对神经性疼痛大鼠坐骨神经组织形态学的影响(HE染色,×200)

2.3UTI对神经性疼痛大鼠炎性因子水平的影响:与Sham组相比,CCI组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)；与CCI组相比,UTI组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显降低(P<0.05)；与UTI组比较,UTI+FK506组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05),见表1。

表1 UTI对神经性疼痛大鼠炎性因子水平的影响

2.4UTI对神经性疼痛大鼠坐骨神经细胞凋亡的影响:与Sham组相比,CCI组大鼠坐骨神经细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与CCI组相比,UTI组大鼠坐骨神经细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；而UTI+FK506组大鼠坐骨神经细胞凋亡率较UTI组明显升高(P<0.05)(见图3)。

图3 UTI对神经性疼痛大鼠坐骨神经细胞凋亡的影响(TUNEL染色,×200)

2.5UTI对神经性疼痛大鼠CN和IL-10蛋白表达的影响:与Sham组相比,CCI组大鼠CN和IL-10蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与CCI组相比,UTI组大鼠CN和IL-10蛋白表达量明显升高(P>0.05)；而UTI+FK506组大鼠CN和IL-10蛋白表达量较UTI组明显降低(P<0.05)(见图4)。

图4 UTI对神经性疼痛大鼠CN和IL-10蛋白表达的影响

3 讨 论

神经性疼痛发病率在普通人群中约占7%～10%左右,该疾病通常以刺痛、灼热痛等自发性疼痛及痛觉异常、痛觉超敏等刺激诱发样疼痛为主要表现,且具有易反复、持续性发作的特点,严重影响患者日常生活和工作,已成为世界性的公共卫生难题。而当前临床上尚无彻底治愈神经性疼痛的方法。UTI作为一种蛋白酶抑制剂,研究证实其通过抗炎、清除氧自由基等发挥对神经损伤、脊髓损伤及重要脏器等的保护功能,是一种强效的抗炎、抗氧化剂[6]。Nie等[7]报道,右美托咪定和UTI对长春新碱所致大鼠神经性疼痛具有协同镇痛效果,作用机制可能与调控α2-肾上腺素能受体(α2-AR)和IL-10表达相关。但UTI作用于神经性疼痛的分子机制尚未完全明确。本研究建立CCI大鼠模型,观察UTI对坐骨神经损伤所致神经性疼痛的镇痛效应。结果显示,CCI模型大鼠术后3、7、10、14d术侧MWT和TWL显著性降低,同时HE结果显示,CCI组大鼠坐骨神经纤维结构紊乱、分布不均匀、神经纤维密度降低,呈收缩状或空泡状,存在明显的炎性浸润及水肿现象,表明CCI大鼠模型建立成功。UTI则对CCI诱导的神经性疼痛大鼠机械痛敏、热痛敏和坐骨神经组织病理性损伤具有一定改善作用。

神经性疼痛动物模型实验表明[8],促炎细胞因子在神经性疼痛的发病过程中起着非常重要的作用,其中TNF-α、IL-6、IL-1β作为主要的促炎因子介导了神经性疼痛的发生和维持。而过度的炎症反应刺激会导致神经系统中氧化应激水平增高,进而引起神经细胞凋亡,加剧神经性疼痛。已有研究表明[9],抑制神经细胞凋亡能够缓解神经性疼痛症状。本研究结果发现,UTI可显著降低神经性疼痛大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平,减轻神经性疼痛大鼠的炎症反应,进而改善神经性疼痛大鼠坐骨神经中细胞凋亡情况,最终缓解CCI诱导的神经性疼痛。

钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CN)广泛分布于哺乳动物的脑、心脏、肝脏、骨骼肌等各种组织中,其在神经系统中的表达水平比其他部位高10～20倍。CN参与神经系统痛觉调节,脊髓背角内CN的缺失可导致CCI引起的神经性疼痛,而鞘内注射外源性CN则能逆转神经性疼痛引起的机械性疼痛和热痛觉过敏[10]。Boubali等[11]报道,CN通过激活肌细胞增强因子2(MEF2)和活化T细胞核因子(NFAT)调节T淋巴细胞中细胞因子基因的表达,而MEF2是T淋巴细胞中IL-10基因转录的重要靶点。提示CN可调控IL-10的产生。IL-10作为一种抗炎细胞因子,在炎症过程中起负向调控作用,能够有效抑制所有促炎因子的合成及其生理作用。相关研究表明[12],IL-10在神经性疼痛中表达降低,而外源性注射IL-10能够缓解神经性疼痛。本研究为探究神经性疼痛中UTI与CN、IL-10的关系,采用Western blot法检测相关蛋白表达水平,结果显示,UTI可显著上调CCI诱导的神经性疼痛大鼠坐骨神经组织中CN和IL-10蛋白表达量。而CN抑制剂FK506可显著减弱UTI对神经性疼痛大鼠的作用效果以及对CN、IL-10蛋白表达量的调控作用。提示UTI可能通过调控CN/IL-10信号通路发挥对神经性疼痛的镇痛效应。

综上所述,UTI可通过减轻炎症反应及细胞凋亡缓解神经性疼痛,其作用机制可能与调控CN/IL-10信号通路有关。本研究为神经性疼痛的治疗提供了新的候选药物和潜在靶点。关于UTI对神经性疼痛的镇痛作用是否存在其他机制,以及UTI作用于神经性疼痛的适宜剂量,还需进一步探索研究。