八月札水提物对胶质瘤细胞EMT的作用机制研究

刘 军, 祁大勇, 赵志煌, 李 刚, 韩永刚

(1.河北省邯郸市第一医院神经外科, 河北 邯郸 056000 2.河北省唐山市工人医院神经外科, 河北 唐山 063000 3.河北省沧州市中心医院神经外科, 河北 沧州 061000)

脑胶质瘤是颅内常见的中枢神经系统恶性肿瘤,具有恶性程度高、侵袭性强、预后效果差及病死率高等特点,受到全球的高度关注[1]。八月札又名“八月楂”,是木通属植物成熟果实的总称,其主要成分为常春藤皂苷元。研究表明,常春藤皂苷元可作为有效的自噬抑制剂,从而增强肺癌细胞对紫杉醇和顺铂的敏感性[2]。此外,常春藤皂苷元通过调节凋亡相关蛋白,可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡,降低其增殖活性[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长度超过200个核苷酸的一种非编码RNA,主要参与染色质修饰和转录,LncRNA肿瘤易感基因(LncRNA CASC11)与多种肿瘤的发生发展有关,研究发现,在膀胱癌和食管癌等恶性肿瘤中CASC11均出现高表达[4,5]。微小RNA(micro RNA,miRNA)是长度在25个核苷酸内的非编码RNA,研究报道,miR-641表达下调与低密度脂蛋白诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移和侵袭有关[6]。本研究以胶质瘤细胞SHG-44为研究对象,探讨八月札水提物是否可通过调节CASC11/miR-641信号轴影响胶质瘤细胞的生物行为学及对上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。

1 材料与方法

1.1细胞系:胶质瘤细胞SHG-44购自美国ATCC公司。

1.2试剂和仪器:八月札购自安徽亳州奇弘堂药业有限公司,水提物制备：将中药粉碎后按1∶8比例加入蒸馏水,浸泡15h后,煮沸30min,收集药液,重新加入蒸馏水煮30min后,收集药液,将2次收集的药液混匀后,45℃减压浓缩,干燥后得到八月札水提物固体干粉,使用前用蒸馏水进行稀释。

1.3CASC11 si-NC和CASC11 mimic(上海吉玛制药公司)；CASC11和miR-641 PCR引物(广州锐博生物科技有限公司)；兔抗人上皮钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)、神经钙粘蛋白(N-cadherin,N-cad)和波形蛋白(vimentin)(美国Abcam公司)；荧光定量PCR仪(美国AMI公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.4MTT法检测细胞存活率:取对数生长期的SHG-44细胞,重悬,制成密度为1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μL,待贴壁后,不同浓度(0、30、60、90、120和180μg/mL)八月札水提物培养,24h后,MTT液10μL培养4h,加入150μL二甲基亚砜,混匀,酶标仪450nm波长处测定吸光度(A)值,计算细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5细胞转染与分组:取对数生长期的SHG-44细胞,重悬,制成密度为1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μL,随机分为对照组、八月札水提物组、NC组、CASC11 mimic组和八月札水提物+CASC11 mimic组,待细胞融合度达到80%以上时,八月札水提物组细胞用含八月札水提物90μg/mL的培养基培养24h,NC组细胞转染NC 24h,CASC11 mimic组细胞转染CASC11 mimic 24h,八月札水提物+CASC11 mimic组细胞转染CASC11 mimic 24后,弃掉原有培养基,加入含八月札水提物90μg/mL的培养基继续培养24h,对照组和八月札水提物组不做处理。

1.6qRT-PCR检测CASC11和miR-641表达水平:离心收集细胞,Trizol液提取总RNA,将1μL总RNA逆转录得到cDNA,以cDNA为模板进行扩增,PCR反应条件为95℃ 10min,95℃ 30s,60℃ 15s,72℃ 20s,共进行40个循环,根据获得的扩增曲线和Ct值,分别以GAPDH和U6为内参基因,用2-ΔΔCt方法计算CASC11和miR-641表达水平,引物序列见表1。

表1 CASC11和miR-641引物序列

1.7双荧光素酶报告基因检测CASC11和miR-641的靶向关系:TargetScan软件预测CASC11基因3’端含有与miR-641相结合的潜在位点,扩增出含miR-641结合位点的CASC11基因3’端和3’端突变后的UTR序列,构建载体并获得野生型CASC11(CASC-wt)和突变型CASC11(CASC11-mut)重组质粒,将重组质粒与miR-641 mimic或NC-mimic共转染至SHG-44细胞,培养48h后,测定荧光素酶相对活性,荧光素酶相对活性=海参荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性。

1.8划痕实验检测细胞愈合面积百分比:将细胞制成单细胞悬液,以1×105个/孔的密度接种于6孔板,细胞贴壁后,10μL无菌枪头均匀划线,PBS清洗细胞碎片,培养,划线0h和48h时在显微镜下拍照,计算划痕愈合面积百分比,划痕愈合面积百分比(%)=(0h划痕面积-48h划痕面积)×100%。

1.9Transwell实验检测细胞侵袭能力:Transwell上室中铺满基质胶,将细胞制成单细胞悬液后每孔接种1×105个细胞,下室中每孔加入600μL培养基,置于培养箱中培养48h,取出小室,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,显微镜下拍照并计数。

1.10蛋白印迹法检测E-cad、N-cad和vimentin蛋白相对表达量:离心收集细胞,裂解,离心,收集上清,BCA法测定蛋白浓度,煮沸变性。120V电泳1.5h,0.3A湿转2h,室温封闭1h,4℃ E-cad、N-cad、GAPDH和vimentin(1∶1000)抗体孵育过夜,TBST洗膜,二抗(1∶5000)室温孵育1h,TBST洗膜,ECL显色,Image J分析条带灰度值,目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值为目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1细胞存活率检测结果:随八月札水提物浓度的增加,SHG-44细胞的存活率逐渐降低。见表2。

表2 各组细胞存活率比较

2.2qRT-PCR检测CASC11 和miR-641表达水平结果:与对照组比较,八月札水提物组CASC11表达水平降低,miR-641表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与八月札水提物组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组CASC11表达水平升高,miR-641 表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与NC组比较,CASC11 mimic组CASC11表达水平升高,miR-641 表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与CASC11 mimic组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组CASC11表达水平降低,miR-641 表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),对照组和NC组CASC11 和miR-641 表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

2.3双荧光素酶检测结果 CASC11-wt+miR-641 mimic共转染组细胞荧光素酶相对活性低于NC共转染组(P<0.05),而CASC11-mut+miR-641 mimic共转染组和NC共转染组细胞荧光素酶相对活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表4,图1。

表3 各组细胞中CASC11 和miR-641表达水平比较

图1 CASC11与miR-641结合位点和突变位点

表4 相对荧光素酶活性比较

2.4划痕愈合面积百分比检测结果:与对照组比较,八月札水提物组划痕愈合面积百分比降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与八月札水提物组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组划痕愈合面积百分比升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与NC组比较,CASC11 mimic组划痕愈合面积百分比升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与CASC11 mimic组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组划痕愈合面积百分比降低,差异有统计学意义(P<0.05),对照组和NC组划痕愈合面积百分比比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表5,图2。

表5 各组划痕愈合面积百分比比较

图2 划痕实验检测细胞迁移能力

2.5侵袭细胞数检测结果:与对照组比较,八月札水提物组侵袭细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)；与八月札水提物组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组侵袭细胞数增多,差异有统计学意义(P<0.05)；与NC组比较,CASC11 mimic组侵袭细胞数增多,差异有统计学意义(P<0.05)；与CASC11 mimic组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组侵袭细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)；对照组和NC组侵袭细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表6,图3。

表6 各组侵袭细胞数比较

2.6蛋白印迹法检测结果:与对照组比较,八月札水提物组N-cad和vimentin蛋白相对表达量降低,E-cad蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与八月札水提物组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组N-cad和vimentin蛋白相对表达量升高,E-cad蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与NC组比较,CASC11 mimic组N-cad和vimentin蛋白相对表达量升高,E-cad蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与CASC11 mimic组比较,八月札水提物+CASC11 mimic组N-cad和vimentin蛋白相对表达量降低,E-cad蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)；对照组和NC组N-cad、vimentin和E-cad蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表6,图4。

表6 各组细胞中N-cad vimentin和E-cad蛋白相对表达量比较

图3 Transwell实验检测侵袭细胞数

图4 细胞中各蛋白表达情况

3 讨 论

八月札的主要成分为常春藤皂苷,具有广泛的药用价值,Zhang等[7]研究表明,常春藤皂苷可改善弓形虫感染引起的肝损伤。Ma等[8]研究发现常春藤皂苷可抑制博来霉素诱导的肝纤维化。此外,常春藤皂苷具有广泛的抗肿瘤作用,黄颖等[9]研究表明,常春藤皂苷通过调节内质网相关通路,将骨肉瘤细胞阻滞在G1期,从而诱导癌细胞凋亡。

本研究以胶质瘤细胞SHG-44对研究对象,给予不同浓度八月札水提物处理,结果显示：细胞存活率随水提物浓度的升高而降低,提示：八月札水提物可降低胶质瘤细胞的增殖能力。CASC11在多种肿瘤中发挥促癌作用,Yu等[10]研究表明沉默CASC11可抑制新生儿神经母细胞瘤的进展。Yan等[11]报道称CASC11作为一种致癌基因在非小细胞肺癌中发挥作用。与上述研究结果相一致,本研究上调CASC11表达,胶质瘤细胞侵袭和迁移能力增强,而给予八月札水提物可减弱CASC11表达,降低癌细胞侵袭和迁移能力。miR-641在多种肿瘤中起抑癌作用,Kong等[12]研究表明miR-641作为一种抑癌因子在肺癌中发挥抑癌作用。本研究发现SHG-44细胞中miR-641下调,双荧光素酶报告基因法证明CASC11直接靶向作用于miR-641,上调细胞中CASC11表达后,miR-641表达下调。结果提示：八月札水提物通过降低CASC11表达,从而上调miR-641表达,在胶质瘤中发挥抑癌作用。

EMT是指在某些因子的刺激下,上皮细胞向间质细胞转化的现象,与肿瘤细胞的迁移和侵袭密切相关,E-cad在实现细胞间稳定接触中发挥重要作用,一旦E-cad表达降低,则直接造成细胞间黏附力降低[13]。N-cad和vimentin都是间质细胞标志物,二者表达升高意味着EMT的发生。本研究中CASC11表达上调,可降低细胞中E-cad的表达,同时N-cad和vimentin表达上调,而八月札水提物可改变CASC11的作用,升高E-cad蛋白表达,而降低N-cad和vimentin蛋白表达。结果提示：八月札水提物可逆转CASC11诱导的上皮间质转化过程。

综上所述,八月札水提物可降低胶质瘤细胞SHG-44增殖、迁移和侵袭,其可能是通过调节CASC11/miR-641信号轴逆转上皮间质转化过程发挥作用,为临床治疗脑胶质瘤提供理论依据。