镧离子和酸根离子在镧盐诱导HepG2细胞特定基因表达改变中的作用

邢云昆，陈 洁，周小琰，马 雪，周 川，付娟玲，祁妍敏，郝卫东，姚碧云，赵 鹏

（1.北京大学公共卫生学院毒理学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191；2.北京大学附属中学，北京 100190；3.中国民用航空局民用航空医学中心，北京 100123）

由于金属的不可溶性，一直以来，在金属毒性研究中，通常选择金属的盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐等无机盐或乙酸盐等有机盐作为受试物，并将金属盐的毒性等同于金属的毒性。将金属盐的毒性等同于金属的毒性的假设已经被大多数毒理学研究者所接受，并且在一定程度上已成为共识。在许多体内、外实验研究中，观察到同一金属的不同盐类毒性存在差异，如氯化铝和硫酸铝、氯化铅和硫酸铅及氯化镉、硫酸镉和醋酸镉等[1-4]。以机体所需的钠离子为例，其氟盐和硝酸盐可造成细胞氧化损伤，导致细胞凋亡；亚硝酸钠更是与前列腺癌风险正相关[5-9]。这些都是酸根离子毒作用的直接证据。此外，同种金属不同盐的毒性可能也不同。研究铜盐对HepG2细胞的毒效应时，同样处理48 h，氯化铜的半数致死剂量（median lethal dose，LD50）为750 μmol· L-1（即 Cu2+0.75 mmol· L-1和 Cl-1.5 mmol·L-1），而硫酸铜的LD50为（220.5±23.8）μg·mL-1〔即 Cu2+（1.38±0.15）mmol·L-1和 SO42-（1.38±0.15）mmol·L-1〕[10-11]。 经饮水对 大 鼠进行 亚 慢性染毒，柠檬酸铝水溶液100 mmol·L-1（即Al3+100 mmol·L-1和 C5H7O5COO-300 mmol· L-1）与430 mg·L-1氯化铝水溶液（即Al3+15.93 mmol·L-1和Cl-47.78 mmol·L-1）可对大鼠红细胞的损害作用程度相近[12-13]。是什么导致了此种毒性效应差异，及酸根离子在金属盐诱发的毒效应中是否也发挥作用，这些问题目前尚未引起毒理学研究的关注。既往研究中有关酸根离子在金属盐毒性中的作用，也并未得到重视。

稀土元素是指一系列在自然界存在的化学性质相似的金属[14]。镧作为轻稀土元素的代表，具有较强的生物活性，镧盐被广泛应用于农业生产等各个领域，因此镧也成为典型的食品污染物之一[15-17]。有研究指出，镧盐的毒性以硝酸盐最大，硫酸盐次之，其后依次为乙酸盐、丙酸盐、氯盐及氧化物[18]。本课题组前期转录组测序结果显示，硝酸镧〔La（NO3）3〕1.41 mmol·L-1处理 48 h 可诱导人肝癌HepG2细胞丙氨酰氨基肽酶（alanyl aminopeptidase，ANPEP）、细胞色素P450家族1A1（cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1，CYP1A1）、氧化固醇结合蛋白样7（oxysterol binding protein like 7，OSBPL7）、CYP3A5、钙电压门控通道辅助亚单位γ4（calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 4，CACNG4）、双特异性磷酸酶 4（dual specificity phosphatase 4，DUSP4）、Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1（Ras protein specific guanine nucleotide releasing factor 1，RASGRF1）和CYP17A1基因mRNA表达上调。这些基因参与细胞的代谢通路涉及类固醇激素生物合成、视黄醇代谢和外源化学物经细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）生物转化等及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路。La（NO3）3对上述基因的诱导可能是其影响肝细胞代谢功能和（或）增殖的分子基础。为探讨酸根离子在金属盐毒性中的可能作用，本研究选择硫酸镧〔La2（SO4）3〕、氯化镧（LaCl3）和La（NO3）3作为金属盐的模型受试物，以分析硫酸根离子（SO42-）、氯离子（Cl-）和硝酸根离子（NO3-）分别在其镧盐诱导HepG2细胞上述8个基因表达改变中的作用，为金属毒性评价和机制研究提供新的思路和线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

La2（SO4）3、LaCl3、La（NO3）3·6H2O、青霉素、链霉素和胰蛋白酶，美国Sigma公司；MEM培养液，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Corning公司；CCK-8检测试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司；FastKing cDNA第一链合成试剂盒和SuperReal PreMix Plus（SYBR Green），北京天根生化科技有限公司；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）基因引物（表1），生工生物工程（上海）有限公司；Invitrogen TRIzol®试剂，美国ThermoFisher公司；硫酸、盐酸、硝酸、氯仿、异丙醇和无水乙醇等试剂，北京化工厂。SCI-165D CO2恒温培养箱，日本ASTEC公司；CFX96™荧光定量PCR仪和iCycler基因扩增仪，美国Bio-Rad公司。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 细胞培养

人肝癌HepG2细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。用含10%胎牛血清的MEM培养液（完全培养液）将HepG2细胞培养于37℃，5% CO2及饱和湿度培养箱中。待细胞生长至80%～90%融合时，按1∶3比例传代。

1.3 实验分组和受试物配制

课题组前期有关La（NO3）3的研究发现，La3+1.41 mmol·L-1染毒 48 h可抑制HepG2细胞存活，但不诱导细胞死亡。因此，本研究选择该浓度作为 La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3的受试浓度。具体分10组：细胞对照组（高纯水）、La2（SO4）30.71 mmol·L-1组（SO42-浓度为 2.12 mmol·L-1）、LaCl31.41 mmol·L-1组（Cl-浓度为4.23 mmol·L-1）、La（NO3）31.41mmol·L-1组（NO3-浓度为4.23mmol·L-1）、H2SO42.12 mmol·L-1组、HCl 4.23 mmol·L-1组及HNO34.23 mmol·L-1组。

因受试物溶解度有限，均配制为2倍（2×）的储备液。La2（SO4）3，LaCl3，La（NO3）3，H2SO4，HCl和HNO3储备液浓度分别为 1.41，2.82，2.82，4.24，8.46和8.46 mmol·L-1。La2（SO4）3，LaCl3和La（NO3）3均是强酸弱碱盐，H2SO4，HCl和HNO3均是强酸，均使培养液呈酸性。为尽可能降低培养液酸碱度对细胞可能产生的影响，本研究对HepG2模型细胞给予受试物处理前，先将受试物储备液与2×MEM完全培养液等体积混匀，配制成含有工作浓度受试物的培养液，并置于培养箱中平衡1 h。经此平衡处理，含La2（SO4）30.71 mmol·L-1，LaCl31.41 mmol·L-1，La（NO3）31.41 mmol·L-1，H2SO42.12 mmol·L-1，HCl 4.23 mmol·L-1和 HNO34.23 mmol·L-1的培养液pH值均恢复到7.25，然后进行细胞染毒。

1.4 CCK-8法测定HepG2细胞存活率

将对数生长期HepG2细胞以每孔5.0×103接种于96孔板中。接种细胞后36 h给予受试物染毒处理，正常培养液培养的细胞为细胞对照组，正常培养液为空白，用于扣除培养液中酚红对吸光度的影响，每组5复孔。受试物处理48 h后，弃培养基，每孔加入100 μL含10%CCK-8的培养液。37℃孵育1 h后，于酶标仪450 nm波长处检测各孔吸光度值（A450nm），计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A450nm-空白组A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白组A450nm）×100%。

1.5 细胞总RNA提取

将对数生长期HepG2细胞以每皿3.0×105接种于直径6 cm的培养皿。接种细胞后36 h给予受试物染毒处理。受试物处理48 h后，弃染毒液，每皿加入TRIzol试剂2.5 mL。室温静置5 min，轻轻吹打细胞使之完全裂解后收集于冻存管中，-80℃保存。

1.6 RT-qPCR检测基因mRNA水平

取1.5细胞总RNA，以总RNA为模板，利用FastKing cDNA第一链合成试剂盒逆转录合成cDNA。采用RT-qPCR检测基因mRNA水平，各基因引物序列见表1。95℃预变性15 min，随即开始PCR反应，95℃变性10 s，51～55℃退火30 s，72℃延伸32 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt法计算总RNA相对表达水平。

1.7 统计学分析

实验数据均为3次重复实验的结果，以±s表示。采用SPSS 27.0软件进行统计学分析。实验组间比较及多重比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA）Fisher最小显著性差异（least significant difference，LSD）法检验，实验组与对照组间比较采用studentt检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3及相应酸根离子对HepG2细胞存活率的影响

如图1所示，与细胞对照组比较，3种镧盐和HCl处理组细胞存活率均降低（P＜0.01），而H2SO4和HNO3处理组细胞存活率未见明显改变。与LaCl3组相比，La2（SO4）3和La（NO3）3组细胞存活率显著降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effects of La2（SO4）3，LaCl3and La（NO3）3and the corresponding acid ions on cell survival in HepG2 cells after 48 h by CCK-8 assay.The concentrations of H2SO4，HCl，HNO3，La2（SO4）3，LaCl3and La（NO3）3were 2.12，4.23，4.23，0.71，1.41 and 1.41 mmol·L-1，respectively.Cell viability（%）=（A450 nmof experimental group-A450 nmof background）/（A450 nmof cell control group-A450 nmof background）×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.##P＜0.01，compared with its corresponding acid group；ΔΔP＜0.01，compared with LaCl3group.

2.2 La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3对 HepG2 细胞ANPEP，CYP1A1，OSBPL7，CYP3A5，CACNG4，DUSP4，RASGRF1和CYP17A1 mRNA表达的影响

如图2所示，与细胞对照组相比，处理48 h后，La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3处理组 HepG2 细胞中ANPEP，CYP1A1，OSBPL7，CYP3A5，CACNG4，DUSP4，RASGRF1和CYP17A1mRNA表达均上调（P＜0.05）。

Fig.2 Effects of La2（SO4）3（A），LaCl3（B）and La（NO3）3（C）on gene expressions in HepG2 cells after 48 h by RT-qPCR.See Fig.1 for treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 SO42-、Cl-和 NO3-对HepG2细胞 ANPEP、CYP1A1，OSBPL7，CYP3A5，CACNG4，DUSP4，RASGRF1和CYP17A1 mRNA表达的影响

经过平衡后，含 H2SO42.12 mmol·L-1，HCl 4.23 mmol·L-1或 HNO34.23 mmol·L-1的培养液pH值均恢复到7.25，因此在H2SO4，HCl或HNO3处理细胞后所测基因表达的变化主要归因于各自的酸根离子，即SO42-，Cl-或 NO3-。

基层是宣传工作的第一线，主要目的是为基层群众传播党的政策、传递政令。任何一项中央的路线、方针、政策出台后，都需要宣传到广大人民群众中去，才能实现统一思想，凝聚力量的目标。实践证明，党和国家任何大的战略部署，任何好的方针政策，任何为人民群众谋利益的重要举措，如果不通过卓有成效的基层宣传工作，使之变为人民群众积极、自觉的行动或取得人民群众的理解和支持，都难以取得预期效果。但很多基层单位在宣传工作中，存在着照本宣科，习惯用官话、空话、套话，方式单一，针对性不强，没有找准定位和结合点，没有用群众自己的语言宣传等问题，导致宣传流于形式，认可度不高，效果不好。

如图3所示，与细胞对照组相比，经SO42-2.12 mmol·L-1处理 48 h后，ANPEP和CYP1A1mRNA 表达上调（P＜0.05）；CYP3A5，DUSP4，RASGRF1，CYP17A1，OSBPL7和CACNG4mRNA表达无明显改变（图3A）。经Cl-4.23 mmol·L-1处理48 h后，仅CYP1A1mRNA表达上调（P＜0.05），其余7个基因mRNA表达水平未见明显改变（图3B）。而经NO3-4.23 mmol·L-1处理48 h后，ANPEP和CYP3A5mRNA 表达上调（P＜0.05），CYP1A1和CACNG4mRNA表达下调（P＜0.05），其余4个基因表达水平无明显改变（图3C）。上述结果表明，酸根离子SO42-，Cl-和 NO3-可影响HepG2细胞特定基因的表达。

Fig.3 Effects of SO42-（A），Cl-（B）and NO3-（C）on gene expressions in HepG2 cells after 48 h by RT-qPCR.See Fig.1 for treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 La3+对HepG2细胞ANPEP，CYP1A1，OSBPL7，CYP3A5，CACNG4，DUSP4，RASGRF1和CYP17A1 mRNA表达的影响

分别以 H2SO42.12 mmol·L-1，HCl 4.23 mmol·L-1和HNO34.23 mmol·L-1作为对照，分析La2（SO4）3，LaCl3和La（NO3）3中La3+（1.41 mmol·L-1）对HepG2细胞上述基因mRNA表达的影响。结果如图4所示，La2（SO4）3和LaCl3的La3+均可诱导HepG2细胞中全部8个基因mRNA表达上调（P＜0.05）。La（NO3）3的La3+亦可诱导上述基因mRNA表达上调，除ANPEP外,其余7个基因mRNA表达均明显上调（P＜0.05）。

Fig.4 Effects of La3+derived from La2（SO4）3（A），LaCl3+（B）and La（NO3）3（C）on gene expressions in HepG2 cells after 48 h by RT-qPCR.See Fig.1 for treatment.x ± s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SO42-（H2SO4），Cl-（HCl）or NO3-（HNO3）group of Fig A，B and C respectively.

2.5 镧盐与其La3+对HepG2细胞8种基因mRNA表达诱导作用的比较

分别比较 La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3与其La3+对HepG2细胞基因mRNA表达的诱导倍数（2-ΔΔCt），结果如图5所示。

Fig.5 Comparison of effects of lanthanum salt and corresponding La3+on gene expressions in HepG2 cells by RT-qPCR.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with La2（SO4）3，LaCl3or La（NO3）3group of Fig A，B and C respectively.

与 La2（SO4）3比较显示 ，La3+对CYP1A1，CYP3A5，DUSP4和CYP17A1mRNA表达的诱导倍数降低（P＜0.05），对其余4个基因表达的诱导倍数无明显差异（图5A）。

与 LaCl3比较，La3+对CYP3A5和RASGRF1mRNA表达的诱导倍数降低（P＜0.05），对其余6个基因mRNA表达的诱导倍数无明显差异（图5B）。

与La（NO3）3比较，La3+对CYP3A5和CYP17A1mRNA表达的诱导倍数降低（P＜0.05），对其余6个基因mRNA表达的诱导倍数无明显差异（图5C）。

2.6 不同镧盐的La3+对HepG2细胞基因mRNA表达诱导作用的比较

Fig.6 Effects of La3+derived from La2（SO4）3，LaCl3and La（NO3）3on gene mRNA expressions in HepG2 cells.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with La3+of La2（SO4）3；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with La3+of LaCl3.

与 La2（SO4）3的 La3+比较，LaCl3的 La3+对ANPEP，CYP1A1，OSBPL7，CYP3A5，CACNG4，DUSP4和RASGRF1等7个基因mRNA表达的诱导倍数无明显差异，而对CYP17A1mRNA表达的诱导倍数降低（P＜0.05）；La（NO3）3的La3+对ANPEP和CYP1A1mRNA表达的诱导倍数无明显差异，而对OSBPL7，CYP3A5，DUSP4，RASGRF1和CYP17A1mRNA表达降低（P＜0.05），对CACNG4mRNA表达的诱导倍数升高（P＜0.05）。

与 LaCl3的 La3+比较，La（NO3）3的 La3+对CYP1A1，DUSP4和CYP17A1mRNA表达的诱导倍数无明显差异，而对ANPEP，OSBPL7，CYP3A5和RASGRF1mRNA表达的诱导倍数降低（P＜0.05），对CACNG4mRNA表达诱导倍数升高（P＜0.05）。

3 讨论

为初步探究金属盐诱发的毒效应是否完全归因于金属离子，酸根离子是否也发挥作用，本研究选择La（2SO4）3，LaCl3和La（NO3）3作为金属盐的模型化学物，分析了La3+与酸根离子SO2-，Cl-和NO-43分别在 La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3诱导 HepG2细胞基因表达改变中的作用。

如上所述，La（2SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3均为强酸弱碱盐，溶解后可使培养液呈酸性，故理论上镧盐诱导细胞基因表达改变可能归因于3个因素，即La3+、酸根离子（SO42-，Cl-和NO3-）和因 La3+破坏水的电离平衡而产生的H+。H2SO4，HCl和HNO3作为强酸，其对细胞基因表达的影响可能归因于2个因素，即酸根离子（SO42-，Cl-和 NO3-）和 H+。为了确定酸根离子对基因表达的影响，本研究通过在培养箱中预先平衡的方法使各实验组培养液的酸碱度均恢复到与正常使用培养液一致，即消除各组间H+的差异。经平衡后，理论上镧盐对基因表达的影响可归因于2个因素，即La3+和酸根离子（SO42-，Cl-和NO3-）；而3种酸对基因表达的影响可归因于酸根离子SO42-，Cl-和 NO3-。通过将 H2SO4，HCl和HNO3组分别与细胞对照组的比较，可以确定酸根离子SO42-，Cl-和 NO3-对HepG2细胞基因表达的影响；通过 La2（SO4）3与 H2SO4组、LaCl3与 HCl组及La（NO3）3与HNO3组比较，可确定La3+对HepG2细胞基因表达的影响，从而实现对镧盐诱导HepG2细胞基因差异表达的归因分析。

将金属盐的毒性等同于金属的毒性有一个前提，即酸根离子无毒性，而且与金属离子之间不存在联合毒作用。“酸根离子无毒性”不仅与“剂量决定毒作用”的共识相违背。而且本研究发现，La2（SO4）3，LaCl3或 La（NO3）3对 HepG2 细胞特定基因mRNA表达的诱导作用与其La3+的作用均存在一定的差异，且无论SO42-和 Cl-，还是 NO3-均能引起HepG2细胞特定基因mRNA表达的改变，如SO42-和Cl-均诱导CYP1A1mRNA的表达，NO3-诱导CYP3A5mRNA的表达，却抑制CYP1A1mRNA的表达。上述理论分析和本研究结果表明，“酸根离子无毒性”这一前提并不成立，La3+与酸根离子对特定基因表达的诱导可能存在联合作用。

通过对La（2SO4）3，LaCl3和La（NO3）3诱导基因表达改变的归因分析，本研究发现La2（SO4）3和LaCl3中的La3+均能诱导HepG2细胞ANPEP，CYP1A1，OSBPL7，CYP3A5，CACNG4，DUSP4，RASGRF1和CYP17A1mRNA表达上调，但对CYP1A1，CYP3A5，DUSP4和CYP17A1mRNA表达的诱导作用低于其盐 La2（SO4）3，对CYP3A5和RASGRF1mRNA表达的诱导作用低于其盐LaCl3。虽然 La（NO3）3中的 La3+亦能诱导上述 8 个基因mRNA表达上调，但对ANPEPmRNA的上调无统计学意义，而且对CYP3A5和CYP17A1mRNA表达的诱导作用低于La（NO3）3。这些结果一方面表明在La（2SO4）3，LaCl3和La（NO3）3所诱导的基因表达改变中La3+发挥主要作用，另一方面也提示酸根离子的作用及其与La3+之间可能存在联合作用。由此可见，镧盐对HepG2细胞基因表达的影响是La3+和酸根离子（SO42-，Cl-和 NO3-）共同作用的结果，不应仅归因于La3+。而酸根离子本身的作用及其与金属离子的联合作用可能是同种金属的不同盐的毒性存在差异的原因之一。

生物转化是机体对外源化学物进行处置的重要环节，可直接影响外源化学物的体内毒动学过程和活性（代谢解毒或代谢活化）。CYP450酶系作为体内最重要的氧化酶，参与催化包括药物、环境化学物在内的多种外源化学物的代谢以及胆固醇、类固醇和其他脂质合成的多种反应。本研究测定的8个基因中包含3种CYP450酶的编码基因，即CYP1A1，CYP3A5和CYP17A1。CYP1A1可被多环芳烃化合物（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）所诱导，在苯并[a]芘等致癌性PAH类环境污染物的代谢活化中发挥重要作用；而且多项研究表明，该基因多态性与癌症易感性有关[19-21]。CYP3A5主要参与药物及类固醇激素睾酮和孕酮的代谢[22-23]。本研究结果表明，SO42-和Cl-对CYP1A1mRNA表达具有诱导作用；NO3-对CYP3A5mRNA表达具有诱导作用，对CYP1A1mRNA表达具有抑制作用。提示酸根离子可能影响机体的生物转化功能，在联合毒作用和联合药理作用中具有潜在的毒理学和药理学意义。鉴于生物转化在维持机体稳态及外源化学物代谢解毒或活化中不可或缺的作用，酸根离子对代谢酶谱的影响值得系统研究。

需要指出的是，本研究通过预先在培养箱中平衡的方法使各实验组染毒体系的酸碱度基本一致，即消除了H+的作用，因此理论上本研究所得到的结果在一定程度上高估或低估了 La2（SO4）3，LaCl3，La（NO3）3，H2SO4，HCl和 HNO3等受试物对 HepG2细胞基因表达的影响。另外，本研究只初步分析了镧离子和酸根离子在镧盐诱导HepG2细胞基因表达改变中的作用，属于体外毒效学研究。实际上金属盐在体内发挥毒作用的情况远比体外复杂，包括完整的吸收、分布、代谢和排泄过程。酸根离子是否影响金属离子的毒动学和生物转化过程，进而影响其靶器官毒作用亟待进一步深入研究。

综上所述，La3+与酸根离子SO42-，Cl-和 NO3-均可诱导HepG2细胞特定基因mRNA表达的改变，La2（SO4）3，LaCl3和 La（NO3）3对 HepG2 细胞基因mRNA表达的影响是La3+与酸根离子SO42-，Cl-和NO3-共同作用的结果，不应仅归因于La3+。由此推断，金属盐的毒性亦不应完全归因于金属离子的毒性，酸根离子的作用不应也不能被忽略。建议在开展有关金属毒性及相关机制的研究中，设置合理的对照，更准确地表征金属离子的毒性及可能机制。开展酸根离子的毒动学和毒效学探索也将为金属毒性及机制研究提供新的思路和线索。