稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建*

陶美彤，朱 伟，舒 凡，陈 昱，张 蓉，谢雅彬，谢 伟，巴德仁贵，姜树原，刘晓蕾，邵 国,6，贾小娥，周成江

(1.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040；2.包头医学院神经科学研究所； 3.内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室；4.包头医学院药学院；5.包头市第三医院；6.首都医科大学宣武医院低氧适应转化医学北京市重点实验室)

人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞系是一种分化程度较低的肿瘤细胞。该细胞繁殖快，细胞形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似。被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究。细胞自噬是细胞的“自食”现象，是指细胞将自身的受损细胞器或者蛋白质包裹进入一个双层膜结构的自噬小体，再与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，在溶酶体的酸性环境中，所包裹的物质被各种酶降解的过程[1]。它参与细胞对外界刺激发生反应，参与机体发育过程，并与衰老、肿瘤发生和发展、肌肉和神经退行性疾病等病理过程有关[2-4]。由于自噬是个动态的过程，检测自噬的方法较少，其中微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白在细胞质中形态的改变是检测自噬现象的一种标准方法之一[5]。本实验建立EGFP-LC3融合蛋白表达的细胞模型并诱导神经母瘤细胞自噬的发生，为进一步研究自噬作用的分子机制及生物学功能提供实验基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)，MEM、F12、FBS、谷胱甘肽(Gluta-max)、丙酮酸钠(Sodium pyruvate)、非必需氨基酸(NEAA)均购于Gibco公司，NaHCO(凯通化学试剂公司)，嘌呤霉素(biosharp公司)，溶酶体荧光燃料-LysoTracker Red DND-99(赛默飞世尔科技公司)，EGFP抗体(invitrogen公司)，LC3抗体(CST公司)，α-Tubulin抗体(Sigma公司)，羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(Multisienses公司)。

1.2细胞培养 采用10.0 %FBS完全培养基(含43.5 %MEM、43.5 %F12、10.0 %FBS、1.0 %Gluta-max、1.0 %Sodium pyruvate、1.0 %NEAA)培养，在37℃、5.0 %CO2、湿化的培养箱中培养，2～3 d 换液1次，隔4～5 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3构建慢病毒表达载体及制备慢病毒颗粒 委托上海吉凯公司构建慢病毒EGFP-LC3-GV348表达载体后，用限制性内切酶AgeI和EcoRI进行酶切鉴定。采用三质粒共转染293 T细胞，收集转染后48 h的293 T细胞上清液，经浓缩与纯化收获高浓度的病毒液。

1.4感染人神经母细胞SH-SY5Y 消化SH-SY5Y细胞，取1×105个细胞到12孔板中，待细胞贴壁后，按感染复数MOI(multiplicityofinfection)=30的比例，每孔先加入485 μL 10.0 %FBS完全培养基，再加入15 μL慢病毒原液，37 ℃、5.0 %CO2培养12 h后，弃含病毒的旧培养液，PBS洗2次，用1 mL 10.0 %FBS完全培养基继续培养至72 h。弃旧培养液，用PBS洗2次，加入1 mL新培养液和3 μg/mL嘌呤霉素，37 ℃、5.0 %CO2培养1个月，获得抗嘌呤霉素的稳转EGFP-SY5Y细胞株和EGFP-LC3-SY5Y细胞株，并在共聚焦显微镜下观察及拍照。

1.5细胞染色和细胞爬片 按照Red DND-99说明书操作染溶酶体后，弃掉培养基，用PBS洗30 s，用4.0 %多聚甲醛于4 ℃固定20 min后，PBS洗5 min，Hoechest(按1:2000用PBS稀释)室温、避光染15 min，弃去染液，用PBS洗三次，2 min/次，加抗淬灭剂封片并在共聚焦显微镜下拍照。

1.6自噬的诱导及鉴定 设立细胞对照组、饥饿处理组(无血清培养基培养8 h)以及氯喹(Chloroquine)处理组(无血清培养8 h+氯喹4 h)。在60倍的共聚焦显微镜下观察，EGFP-LC3蛋白的绿色荧光是否聚集成点状、是否与红色荧光融合。根据之前的报道[6]，将细胞中产生2个及以上EGFP-LC3点的细胞定义为阳性细胞，统计100个细胞，计算EGFP-LC3点阳性细胞占总细胞的百分比，百分比越大说明自噬越强。经过3次重复实验并统计计算。

1.7Western blot检测LC3的表达 收集细胞，加入适量RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂后在冰上超声裂解，离心后煮沸10 min，取上清蛋白进行12.0 % SDS、120 V电泳，结束后100 V转膜2 h，转膜后用5.0 %脱脂奶粉于室温封闭1 h，然后加入用5.0 %脱脂奶粉稀释的EGFP(1∶1000)抗体或LC3(1∶1000)抗体或α-Tubulin(1∶1000)抗体，4 ℃平摇过夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入用5.0 %脱脂奶粉稀释的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，4 ℃平摇4 h，TBST洗膜3次，10 min/次，用化学发光法显影，扫描图像并保存。

2 结果

2.1EGFP-LC3质粒的鉴定 经AgeI和EcoRI酶切证实成功构建EGFP-LC3-GV348序列的慢病毒表达载体(图1)。

图1 EGFP-LC3-GV348表达载体的鉴定

2.2稳定表达EGFP-LC3-SY5Y细胞系的构建 Western blot检测到细胞稳定表达LC3蛋白和EGFP-LC3蛋白(见图2)。共聚焦拍照结果显示EGFP和EGFP-LC3成功转染细胞(图3)，细胞稳定地表达绿色荧光。与正常SH-SY5Y相比，EGFP-SY5Y细胞绿色荧光呈弥散性表达，EGFP-LC3-SY5Y出现少量荧光聚集物。溶酶体被Track R99染成红色，可以观察到绿色亮点和红色亮点重合，表示LC3点状聚集物可以代表自噬囊泡，代表自噬小体与溶酶体的结合成自噬溶酶体，并且观察到正常培养的细胞少量地表达自噬。

图2 Western blot结果显示细胞稳定表达EGFP蛋白和EGFP-LC3蛋白

图3 EGFP-LC3-SY5Y能够反映自噬小体

2.3诱导自噬引起EGFP-LC3-SY5Y细胞系中LC3点的增加 正常培养的细胞荧光斑点数在0～2个范围内，EGFP-LC3点的阳性细胞接近10.0 %；经过饥饿处理8 h后，多数细胞点状聚集物增加至3～4个，EGFP-LC3点的阳性细胞占总细胞的百分比为36.0 %；无血清处理8 h并加入氯喹4 h后，多数细胞LC3点状聚集物增加至4个以上，EGFP-LC3点的阳性细胞增加至59.0 %(图4、5)。以上结果说明，在正常培养条件下，细胞中很少或无点状聚集物形成，即没有或少量发生自噬；而经过饥饿条件处理后，阳性细胞数增加，说明自噬增强；加入氯喹后，氯喹提高溶酶体内的pH值，阻止自噬小体在溶酶体中的降解过程，显示自噬小体数量增加。该结果进一步证明构建的EGFP-LC3-SY5Y细胞系可以直观实时观察细胞自噬。

图4 EGFP-LC3-SY5Y能够直观实时反映自噬流

3 讨论

由于自噬与多种疾病关系密切，对于自噬的研究可能为今后的疾病治疗提供新的方法与思路。目前，检测自噬的实验方法主要包括：电镜法，Western blot检测LC3蛋白方法与荧光检测方法[7]。电镜法主要是通过电镜观察细胞内自噬小体或者自噬溶酶体的数量来确定自噬水平[7-8]。但是电镜法实验过程相对复杂，数据分析也需要专业的水平，因此常采用Western blot检测方法与荧光检测方法。LC3蛋白的Western blot检测方法依据自噬发生时LC3-Ⅰ蛋白转变为LC3-Ⅱ蛋白，通过检测LC3-Ⅰ蛋白的减少和LC3-Ⅱ蛋白增多来指征自噬的发生。LC3蛋白的荧光检测方法，用荧光标记LC3内源蛋白或者转染EGFP-LC3蛋白，通过观察荧光是否形成点状，判断自噬水平，点状越多，自噬水平越高[7-8]。因此构建稳定表达EGFP-LC3蛋白的细胞系，采用荧光显微镜方法检测自噬，操作更为简单，结果可视化，是初步判断细胞自噬水平的常用方法，并且适用于大规模药物筛选。

图5 LC3点状聚集物统计图

有研究报告，饥饿条件为引起细胞发生自噬的经典诱导条件，其机制主要包括：抑制mTOR，从而导致ULK复合物与mTOR分离[9]；激活JNK，进而磷酸化Bcl-2，导致Beclin1与Bcl-2分离[10]。饥饿处理后，可能是通过影响这些机制从而导致自噬增加。加入氯喹则是提高溶酶体内的PH值，阻止自噬小体在溶酶体的降解过程，细胞中自噬小体增加。因此通过激活自噬，检测构建稳定表达EGFP-LC3蛋白的SH-SY5Y细胞系能否指示细胞自噬。结果表明，构建的细胞系能够用于指示细胞自噬的水平，为研究神经细胞自噬提供了便捷的检测方法。

在今后的研究中，可以利用本细胞系进一步探索自噬作用的分子机制及生物学功能，以及在神经退行性疾病中自噬的作用及影响。研究通过调节自噬，影响细胞内异常蛋白质清除的能力，缓解神经退行性疾病，为今后的神经退行性疾病的预防和治疗奠定基础。