糖尿病波动性高血糖模型的建立*

刘雪齐，王宝军，梁芙茹，秦明阳

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014040；2.包头市中心医院神经内科；3.呼伦贝尔市第二人民医院内二科)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一组由于胰岛功能衰竭、胰岛素分泌减少，和(或)机体对胰岛素敏感性降低血糖调节机制受损，引起的一组以高血糖为特征的慢性代谢紊乱性疾病[1]。随着我国逐步迈入老龄社会，我国糖尿病患者数量已经超过1亿[2]。我国糖尿病的患病率从也1980年的0.67 %，在短短的40余年间迅速飙升至2020年的12.8 %[3]。随着糖尿病患者的日益增多，规范、正确地控制血糖成为现今糖尿病患者日常生活中的首要任务。糖尿病患者糖代谢紊乱主要分为慢性持续高血糖和慢性波动高血糖两种[4-5]，早在2007年国际糖尿病联盟发布的《餐后血糖管理指南》中就提到：与慢性持续高血糖比较，波动高血糖所产生的危害严重，与此同时血糖波动幅度越大，慢性并发症的发生率也就越高[6-8]，但其确切机制尚不明确。因此研制一种简捷易行的波动性高血糖大鼠模型的方法，能够很好的模拟糖尿病患者的血糖波动状况，为临床研究的深入开展奠定了实验基础。但有关该造模方法国内报道和研究甚少，为此对该方法进行进一步分析及评价，为临床研究有必要进一步探究，并将该方法让更多的人熟知。

1 对象与方法

1.1实验动物 选取4～6周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠40只，体质量在120～150 g，由内蒙古大学动物中心提供[动物使用许可证号：SCXK(蒙)2016-0001]。

1.2药品及仪器 链脲佐菌素(STZ，北京博爱港商贸有限公司)、柠檬酸(北京博爱港商贸有限公司)、柠檬酸钠(北京博爱港商贸有限公司)、普通饲料(北京博爱港商贸有限公司)、高糖高脂饲料(北京博爱港商贸有限公司)、N型手持式血糖仪及配套试纸(CareSens，韩国)、超纯水仪(Thermo公司)、电子天平(Thermo公司)、掌上离心机D1008(上海麦仓生物科技有限公司)、移液枪(DragonLab公司)。

1.3方法

1.3.1柠檬酸缓冲液的配制 A液：柠檬酸2.1 g加入双蒸水100 mL；B液：柠檬酸钠2.94 g加入双蒸水100 mL。将A与B液按1∶1或1∶1.32混合后，调节混合液pH=4.2～4.5。

1.3.2糖尿病动物模型制备 将40只健康雄性Wistar大鼠，环境温度(20 ± 2)℃，相对湿度50 %～60 %，以不及时不计量维持饲料对三组大鼠进行适应性喂养1周后，随机数表法将其随机分为C组(n=10)、T2DM组(n=30)。普通饲料喂养C组，高脂饲料喂养T2DM组大鼠，4周后所有大鼠禁食不禁水15 h后，T2DM组大鼠在高糖高脂饲料喂养4周后，禁食15 h，用新鲜的柠檬酸缓冲液配制1 %的STZ溶液，按30 mg/kg腹腔注射，制备T2DM大鼠模型[9-11]；正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水0.375 g/kg。注射1周后，测定两次非同日空腹血糖(禁食>8 h)，血糖11.1～33.3 mmol/L者视为造模成功，T2DM模型成功27只，成功率为90.0 %。

1.3.3血糖波动模型制备 2型糖尿病大鼠(n=27)稳定后，用随机数表法将2型糖尿病组大鼠分为持续性高糖组(CHG，n=13)及波动性高糖组(n=14)。因大鼠夜间进食的生活习性，为方便喂养，三组大鼠昼夜更替(24小时制)：7:00-19:00为夜间，进行遮光；19:00-7:00为日间，进行光照处理。对照组予以维持饲料不计时不计量喂养；持续高血糖组予以高糖高脂饲料不计时不计量喂养；波动高血糖组大鼠于9:00-10:00及15:00-16:00高糖高脂饲料喂养。

1.4大鼠生长代谢指标采集

1.4.1大鼠一般情况 观察各组大鼠一般状况：大鼠饲养过程中的精神状态、反应能力、四肢皮肤；测量体质量：分别于适应性喂养1周后，高糖高脂4周后，波动性高血糖模型第6周，波动性高血糖模型第10周，即第1周、第5周、第11周及第16周时，每组随机数表法选取6只大鼠，于8:00测量大鼠体质量；第11周时随机选取6只大鼠，将大鼠放于代谢笼内，记录大鼠日间的代谢情况(进食、饮水量及尿量)。

1.4.2血糖波动模型评估 血糖波动第11周时，随机选取8只测量9个时间点(8:00、9:00、10:00、11:00、12:00、15:00、16:00、17:00、18:00)，并绘制血糖变化趋势曲线。

2 结果

2.1一般情况 C组大鼠精神状态良好，反应灵敏，活泼好动，毛色白干净柔顺而有光泽，鼠尾干净无红肿发炎等状况；与C组相比较，CHG组及IHG组大鼠精神萎靡，行动力迟缓，对外界刺激反应迟钝，毛色晦暗无光泽，蜷缩拱背，尿液腥臊味加重、较黏稠，个别大鼠足部出现脓肿、破溃，尾尖溃烂离断；与CHG组相比较，IHG组大鼠上述一般状况更差。CHG组及IHG组大鼠死亡率高：CHG组死亡5只，死亡率38.5 %；IHG组死亡6只，死亡率高达42.9 %。

2.2各组大鼠不同时期体质量情况 三组大鼠体质量情况，第1周(Week 1)：三组间的体质量差异无统计学意义(F=0.009，P=0.991 > 0.05)；第5周(Week 5)：三组间的体质量比较差异有统计学意义(F=8.634，P=0.002 < 0.05)，CHG组及IHG组均显著高于C组(P<0.05)，而CHG组与IHG组间差异无统计学意义(P>0.05)；第11周(Week 11)：三组间的体质量比较差异有统计学意义(F=19.763，P<0.05)，C组与CHG组均显著高于IHG组(P<0.05)，而C组与CHG组间差异无统计学意义(P>0.05)；第16周(Week 16)：CHG及IHG糖尿病大鼠模型稳定后第10周时，三组间的体质量比较差异有统计学意义(F=126.414，P<0.05)，C组最高，CHG组次之，IHG组最低(P<0.05)。见表1。

表1 不同时期体质量水平

2.3各组大鼠日间的代谢情况(进食量、饮水量及尿量) 进食(Food intake，g)：三组间的进食量差异有统计学意义(F=18.805，P<0.05)，C组与IHG组均显著低于CHG组(P<0.05)，而C组与IHG组间无显著差异(P>0.05)；饮水量(Water intake，mL)：三组间的饮水量差异有统计学意义(F=178.940，P<0.05)，CHG组最高，IHG组次之，C组水平最低(P<0.05)；尿量(Urine output，mL)：三组间的尿量差异有统计学意义(F=314.034，P<0.05)，CHG最高，IHG组次之，C组水平最低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠进食，饮水量与尿量的差异

2.4造模第11周日间不同时间点各组大鼠血糖情况 组间比较、时间点比较及交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。提示不同组间、不同时间点血糖水平有显著差异，并且组间与时间存在显著的交互作用。组间两两比较结果显示：与C组相比，CHG组及IHG组各时间点血糖值均显著降低(P<0.05)，8:00时CHG组显著高于IHG组(P<0.05)，10:00、11:00、12:00、16:00、17:00、18:00时间点均为IHG组显著高于CHG组(P<0.05)；组内比较：C组、CHG组均较平稳(P>0.05)；IHG组各时间点两两比较8:00显著低于9:00、10:00、11:00、12:00、16:00、17:00、18:00(P<0.05)，9:00血糖显著低于10:00、17:00(P<0.05)，10:00血糖明显高于15:00、18:00(P<0.05)，12:00显著高于15:00(P<0.05)，15:00显著低于16:00、17:00(P<0.05)，17:00显著低于18:00(P<0.05)。见表3。

表3 不同时间点血糖比较

CHG组及IHG组大鼠血糖明显高于C组，C组及CHG组随时间变化较平稳，IHG组血糖呈波动性，血糖值在10:00左右达第一个高峰，然后呈现出下降趋势，15:00达到最低点，之后血糖于17:00左右达到第二个高峰，随后又逐渐下降。见图1。

图1 不同时间点血糖趋势图

3 讨论

与C组相比，CHG组大鼠一般情况差、死亡率高、糖尿病三多一少症状明显、血糖持续升高；与CHG组相比，IHG组大鼠一般情况更差、死亡率更高、糖尿病三多一少症状更明显、日间血糖且呈现波动性。因此经过高糖高脂诱导并联合腹腔小剂量STZ，建立2型糖尿病模型后，通过昼夜颠倒配合限制进食时间的方法成功建立了波动高血糖模型，该方法可更好地模拟临床糖尿病患者的日常血糖波动情况[12-14]。目前，国内外常用的波动高血糖模型方法：腹腔注射葡萄糖、皮下注射胰岛素和定时皮下注射胰岛素并联合错时腹腔注射葡萄糖三种方法[15-17]。这三种方法制备的波动高血糖模型都是通过额外加入葡萄糖或胰岛素的方式来造成血糖波动。研究显示，鼻喷胰岛素的短期治疗可明显改善阿尔茨海默病患者早期的认知水平，并降低Aβ1-42的神经毒性[18-22]。糖尿病大鼠相关认知功能的研究需排除体外胰岛素干扰，并且现今临床上糖尿病患者血糖波动大多由餐后高血糖引起[23-25]。因此，以上三种方式除不能排除体外胰岛素干扰外还不能完全复制临床糖尿病患者的血糖波动情况。因此该方法优点在于可更好地模拟糖尿病患者的血糖波动，并为波动高血糖相关认知功能的研究奠定基础。但实验中尚存在一定的不足：由于一天测9次血糖，大鼠情绪不稳定，影响进食，可能会对实验结果造成一定的影响。

综上所述，高糖高脂联合小剂量STZ的基础上，通过改变大鼠饮食习惯和生活节律可以建立波动性高血糖模型。