山茱萸多糖对胃癌细胞增殖和凋亡的机制

聂志勇，李守淼，王卫杰，李焕焕，袁冬冬

(安阳市肿瘤医院肿瘤内科，河南 安阳 455000)

胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，研究发现中医药具有治疗胃癌的作用，且在提高胃癌患者免疫力及改善生活质量等方面具有一定优势[1-2]。如红景天苷明显抑制胃癌细胞的增殖并通过Bcl/Bax信号通路诱导其凋亡[3]。紫檀芪可能通过ROS激活线粒体途径，从而抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡[4]。山茱萸多糖是山茱萸的主要有效成分，其具有抗氧化、抗衰老、增强免疫功能及抗肿瘤等作用[5]。研究表明，山茱萸多糖可抑制人肝癌HepG2细胞及肺癌A549细胞增殖[6-7]。然而山茱萸多糖是否对胃癌有抗癌作用及其机制尚不清楚。长链非编码RNA(lncRNA)在癌症进展过程中起着至关重要的作用，可作为胃癌诊断，治疗及评估预后等的生物靶点[8]。研究报道，lncRNAELF3-AS1可促进体外膀胱癌细胞的活力和迁移，并促进体内异种移植肿瘤的生长[9]。沉默lncRNA ELF3-AS1可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖[10]。以上研究表明，lncRNA ELF3-AS1可能在癌症中起促癌作用。而lncRNA ELF3-AS1在胃癌中的作用及其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响尚不清楚。本实验旨在研究山茱萸多糖对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制是否与lncRNA ELF3-AS1有关。

1 材料与方法

1.1 材料胃黏膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞株AGS购自上海澳音生物科技有限公司；RPMI 1640完全培养基购自上海雅吉生物科技有限公司；山茱萸多糖购自上海益本生物医药科技有限公司；MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自百奥迈科生物技术有限公司。

1.2 裸鼠荷瘤实验BALB/C裸小鼠购自南京君科生物工程有限公司(动物合格证号；闵20190013)，取对数生长期细胞AGS，消化制成单细胞悬液后，于每只裸鼠右后肢皮下接种2.0×106个细胞；所有裸鼠1周后皮下出现>5 mm的结节时表明移植瘤建立成功。将接种成功后的裸鼠随机分为对照组、山茱萸多糖低、中、高剂量组，每组6只，按分组给药，对照组每天给予蒸馏水灌胃，山茱萸多糖低、中、高剂量组分别按12.5、25、50 g·mg-1剂量给药，每组每天灌胃1次，连续给药10 d；在d 14、21、28时分别处死部分小鼠，剥离肿瘤组织，检测肿瘤体积。取28 d后小鼠肿瘤组织参照“1.5”中方法检测肿瘤组织中Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。

1.3 TUNEL法检测裸鼠肿瘤组织中细胞凋亡指数将裸鼠移植瘤组织进行固定，经石蜡包埋、切片后用二甲苯脱蜡，然后用胰蛋白酶消化，加入TUNEL反应液37 ℃孵育1 h，加入过氧化物酶抗体37 ℃孵育30 min，滴加二氨基联苯胺(DAB)，室温孵育30 min，然后封片，烘干，显微镜下观察，细胞核染色呈棕黄色颗粒的为凋亡阳性细胞，细胞凋亡率/%=(染色阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.4 细胞处理与分组胃黏膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞AGS用RPMI 1640完全培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养，取对数生长期细胞AGS，分别用12.5、25、50 g·L-1的山茱萸多糖处理AGS细胞，作为山茱萸多糖低、中、高剂量组，不作处理的AGS细胞作为对照组；将si-NC、si-ELF3-AS1转染至AGS细胞中，记为si-NC组、si-ELF3-AS1组；将pcDNA、pcDNA-ELF3-AS1转染至AGS细胞后用50 g·L-1的山茱萸多糖处理，记为山茱萸多糖+pcDNA组、山茱萸多糖+pcDNA-ELF3-AS1组。

1.5 MTT检测细胞增殖抑制率取培养48 h的各组细胞，每孔20 μL MTT溶液，孵育4 h后加入150 μL DMSO，振荡反应10 min，用酶标仪检测490 nm处检测吸光度(OD)值。细胞增殖抑制率/%=1-实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡收集培养48 h的细胞，用预冷的PBS漂洗2次，用结合缓冲液重悬，加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot法检测Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表达提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒定量。蛋白样品进行SDS-PAGE，转移至PVDF上，5%脱脂牛奶室温封闭，加入Ki-67、Bcl-2、Bax的一抗，4 ℃孵育过夜；加入山羊抗兔IgG-HRP二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，用Quantity One分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算目的条带蛋白表达水平。

1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA ELF3-AS1表达水平提取细胞总RNA，反转录成cDNA，进行PCR扩增，循环条件为95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；相对表达量采用2-△△Ct法计算。lncRNA ELF3-AS1上游引物序列：5′-TGAAGTCATCACGAACCGC-3′，下游引物序列：5′-GGAGCCCCAAGTTAATGCG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′，下游引物序列：5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′。

2 结果

2.1 山茱萸多糖对胃癌AGS细胞裸鼠移植瘤体积变化的影响不同剂量山茱萸多糖处理的裸鼠14 d、21 d、28 d后，与对照组比较，山茱萸多糖低、中、高剂量组裸鼠移植瘤体积均明显降低(P<0.05)，见Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Changes in volume of transplanted tumors in each group1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

Tab 1 Effect of cornus officinalis polysaccharides on volume changes of gastric cancer AGS cell xenograft tumor in nude mice

Fig 2 Effectof cornus officinalis polysaccharides on tumor cell apoptosis in nude micedetected by TUNEL method1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.2 TUNEL法检测山茱萸多糖对裸鼠肿瘤细胞凋亡的影响不同剂量山茱萸多糖处理的裸鼠28 d后，与对照组[(9.22±0.96)%]比较，山茱萸多糖低、中、高剂量组肿瘤细胞凋亡指数[(29.55±2.56)%、(46.33±4.28%)、(68.26±5.28)%]升高(P<0.05)，见Fig 2。

2.3 山茱萸多糖对裸鼠肿瘤组织增殖和凋亡相关蛋白表达的影响与对照组比较，山茱萸多糖低、中、高剂量组裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(P<0.05)，见Fig 3。

Fig 3 Proliferation and apoptosis-related protein expression1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.4 山茱萸多糖对胃癌AGS细胞增殖及增殖相关蛋白表达的影响与对照组比较，山茱萸多糖低、中、高剂量组胃癌AGS细胞增殖抑制率[(19.04±1.67)%、(32.14±2.96)%、(51.36±3.65)%vs(0.00±0.00)%]升高，Ki-67蛋白表达水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见Fig 4。

Fig 4 Ki-67 protein expression1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.5 山茱萸多糖对胃癌AGS细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响与对照组比较，山茱萸多糖低、中、高剂量组胃癌AGS细胞凋亡率[(13.17±1.13)%、(20.37±2.02)%、(29.56±2.18)%vs(7.64±0.52)%]升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见Fig 5。

2.6 lncRNA ELF3-AS1在胃癌AGS细胞中的表达与GES-1比较，AGS细胞中ELF3-AS1表达水平(3.55±0.24vs1.00±0.07)升高(P<0.05)。

2.7 山茱萸多糖对胃癌AGS细胞中lncRNA ELF3-AS1表达的影响与对照组(1.00±0.06)比较，山茱萸多糖低、中、高剂量组胃癌AGS细胞中ELF3-AS1表达水平(0.77±0.05、0.63±0.04、0.41±0.04)降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

2.8 抑制lncRNA ELF3-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的影响与si-NC组比较，si-ELF3-AS1组ELF3-AS1表达水平降低，细胞抑制率升高，细胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高(P<0.05)，见Fig 6，Tab 2。

Tab2 Effect of inhibiting expression of lncRNA ELF3-AS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS

2.9 lncRNA ELF3-AS1过表达逆转了山茱萸多糖(50 g·L-1)对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的作用与山茱萸多糖+pcDNA组比较，山茱萸多糖+pcDNA-ELF3-AS1组ELF3-AS1表达水平升高，细胞抑制率降低，细胞凋亡率降低，Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)，见Fig 7，Tab 3。

Fig 5 Effect of cornus officinalis polysaccharides on apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Apoptosis-related protein expression;B:Apoptosis flow cytometry；1：Control；2：Cornus officinalis polysaccharides low-dose group；3：Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group；4：Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

Fig 6 Effect of inhibiting expression of lncRNA ELF3-AS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Proliferation and apoptosis-related protein expression;B:Flow cytometric diagram of cell apoptosis

Tab3 Overexpression of lncRNA ELF3-AS1 reversed effect of cornus officinalis polysaccharide on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

Fig 7 Overexpression of lncRNA ELF3-AS1 reversed effect of cornus officinalis polysaccharide on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Proliferation and apoptosis-related protein expression;B:Flow cytometric diagram of cell apoptosis；1：cornus officinalis polysaccharide+pcDNA group；2：cornus officinalis polysaccharide+pcDNA-ELF3-AS1 group

3 讨论

中药治疗胃癌是我国独特的治疗手段，由于目前中药在胃癌中治疗的作用机制尚未完全揭示，使得中药治疗在临床应用中仍存在较大局限性[11-12]。因此，深入研究中医药治疗胃癌的分子机制有助于其临床治疗。研究报道山茱萸多糖可抑制人宫颈癌HeLa及HepG2细胞的增殖，并促进细胞凋亡[13-14]。而山茱萸多糖对胃癌细胞增殖、凋亡的影响尚不清楚。本实验建立皮下移植瘤裸鼠模型，用不同剂量的山茱萸多糖对裸鼠进行灌胃处理，结果显示，裸鼠体内移植瘤体积降低，裸鼠组织中细胞凋亡指数升高，且Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高；说明山茱萸多糖可抑制裸鼠体内移植瘤的生长。为进一步证明山茱萸多糖在体外的作用，用不同浓度山茱萸多糖处理胃癌细胞AGS后，细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，且呈剂量依赖性；表明山茱萸多糖可剂量依赖的抑制胃癌细胞增殖，且可促进细胞凋亡。以上结果表明山茱萸多糖在体内体外均可抑制胃癌细胞的生长。

研究报道lncRNA ELF3-AS1可促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移[15]；促进骨肉瘤细胞的增殖[16]。本实验结果显示，lncRNA ELF3-AS1在胃癌细胞AGS中同样高表达；抑制lncRNA ELF3-AS1表达后，AGS细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高；说明抑制lncRNA ELF3-AS1表达可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，本实验结果显示，山茱萸多糖可降低胃癌细胞AGS中lncRNA ELF3-AS1表达水平；而lncRNA ELF3-AS1过表达逆转了山茱萸多糖对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的作用。

综上所述，山茱萸多糖可能通过下调lncRNA ELF3-AS1抑制胃癌AGS细胞增殖，促进AGS细胞凋亡。本实验发现山茱萸多糖同样对胃癌具有抑癌作用，且可能通过调控ELF3-AS1作用。