TRPV1/SIRT1介导吴茱萸次碱抗Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞衰老

余艳荣，汪小英，祝思路，王寒霞，彭维杰,4，罗 丹

(1.南昌大学基础医学院生理学系，2.南昌大学药学院基础药理重点实验室，江西 南昌 330006;3.阜阳市人民医院药剂科，安徽阜阳 236000；4.赣南医学院，医用组织工程材料与于生物制造江西省重点实验室，江西 赣州 341000)

血管老化是高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病发生、发展的重要病理改变，表现为血管结构和功能的改变，包括动脉内中膜厚度增加，顺应性降低和血管炎症表现。血管老化与构成血管壁的细胞衰老有关，其中衰老的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)出现迁移、表型转变等功能紊乱，并向成骨样细胞分化而加速血管钙化。大量研究发现，血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)，作为肾素血管紧张素系统的关键分子，在高血压、年龄等多种因素诱导的血管老化中起到关键作用。老年人和老龄动物的动脉血管壁及VSMCs中Ang Ⅱ显著增高，而Ang Ⅱ长期刺激可激活衰老通路p53/p21，诱导VSMC出现应激性早衰[1]。

SIRT1(sirtuin1)是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶，参与调控细胞内各种代谢活动，尤其和细胞衰老密切相关，被称为长寿蛋白[2]。检测不同年龄人体血管发现，血管平滑肌中SIRT1水平随年龄增长而显著降低，伴随血管平滑肌功能的改变，提示年龄相关的SIRT1水平下降导致VSMC衰老及功能失调[3]。此外，Ang Ⅱ引起的高血压小鼠血管壁SIRT1水平下降，发生动脉斑块区域的SIRT1表达也较对应正常区域下降[4]。而用药物或基因手段上调SIRT1水平则可明显抑制Ang Ⅱ、高糖和动脉粥样硬化等因素诱导的VSMC衰老和功能紊乱[5]。因而，SIRT1被认为是抑制VSMC衰老和血管老化的热门靶点。

吴茱萸次碱(rutaecarpine，Rut)是中药吴茱萸中的主要活性物质，具有显著的心血管保护效应，其舒血管和降压作用已被广泛研究[6]。我们和其他学者的前期研究表明，Rut可显著抑制Ang Ⅱ引起的VSMC增殖和表型转换，并减轻高血压导致的血管重构[7]。Zhou等[8]报道，在高血压动物模型中，Rut可降低其内皮祖细胞的衰老，且抑制Ang Ⅱ引起的内皮祖细胞衰老，表明Rut具有潜在的抗细胞衰老作用。大量证据表明，Rut的主要心血管效应均与激活瞬时受体电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanillic acid subtype 1，TRPV1)有关，后者广泛存在于心血管系统，VSMC也能表达TRPV1。在Ox-LDL引起的VSMC源性泡沫细胞发现，TRPV1激动剂辣椒素可上调SIRT1的水平，提示TRPV1参与调节SIRT1表达[9]。因而本研究进一步在血管紧张素Ⅱ诱导的VSMC衰老模型中，探讨Rut的保护作用，并研究其信号通路是否与TRPV1/SIRT1途径有关。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂Rut(上海君拓生物技术有限公司)，Ang Ⅱ、TRPV1抑制剂CAPZ(Sigma,USA)，AMPK抑制剂Compound C(Selleck,USA)，β-半乳糖苷酶和活性氧检测试剂盒(江苏碧云天生物有限公司)，SIRT1抗体，p-AMPK抗体和AMPK抗体(Cell Signaling,USA)，p21抗体(ABclonal)，p53抗体(Proteintech)和山羊抗兔/小鼠IgG二抗(武汉BOSTER)；BCA蛋白定量试剂盒，Transwell 小室(3422)(Costor,USA)

1.2 仪器电泳仪和自动曝光仪(BIO-RAD，USA)，荧光显微镜(Olympus,日本)。

1.3 实验分组取出大鼠胸主动脉，组织块贴壁法原代培养VSMCs，传代后取第3～8代用于实验。实验分组如下：① Control组：正常对照组；② Ang Ⅱ诱导衰老组：加入终浓度为1 μmol·L-1Ang Ⅱ孵育VSMCs 72 h；③-⑤不同剂量的Rut保护组：加入的终浓度分别为0.3、1和3 μmol·L-1的Rut孵育VSMCs 10 min后，加入Ang Ⅱ继续孵育72 h；⑥ +CAPZ+Rut组：TRPV1受体阻断剂CAPZ(10 μmol·L-1)预处理细胞10 min后，再加入3 μmol·L-1Rut孵育10 min，最后加入Ang Ⅱ继续孵育72 h。⑦ +Compound C+Rut组：在加入Rut和Ang Ⅱ前，预先加入AMPK阻断剂1 μmol · L-1Compound C孵育VSMC 10 min。

1.4 β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法测定衰老细胞数目细胞衰老时会生成大量的β-半乳糖苷酶，该酶作用于底物X-Gal后，细胞会生成一种蓝色物质。VSMC用Ang Ⅱ 诱导培养3 d后，去上清，各孔分别加入1 mL染色固定液15 min。吸弃染色固定液，用PBS洗3次。加入染色工作液封口膜密封，避光37 ℃烘箱过夜。显微镜下观察拍照，ImageJ软件算出衰老蓝染的细胞数。

1.5 荧光探针法检测细胞内ROS水平荧光探针DCFH-DA自身无荧光，但可自由穿过细胞膜后转化为DCFH，后者可被细胞内的ROS氧化，生成发绿色荧光的DCF，从而间接计算出细胞内的ROS含量。细胞处理结束后，去上清，PBS洗2次。加入1 ∶1 000的DCFH-DA探针，用锡箔纸包裹6孔板，37 ℃避光孵育。0.5 h后用无菌的PBS洗2次，加入1 mL DMEM，镜下进行观察拍照，ImageJ算出荧光量。

1.6 划痕愈合实验测定细胞迁移细胞以2×105/孔的密度种于24孔板，待细胞长至100%后，用灭菌的Tips头进行划线，洗掉被破坏的细胞，再加入serum-free的培养基和对应药物，在各个时间点(0、12、24 h)观察同部位划痕愈合情况。用ImageJ计算细胞的平均划痕宽度，以反映细胞迁移状况。细胞迁移率/%=(0 h划痕宽度-24 h后划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.7 Transwell迁移实验对数生长期的VSMCs消化后，含1%血清的培养液重悬，调整细胞密度为5×108L-1，在小室(8 μm)的每孔上室加入100 μL细胞悬液，下室加入400 μL 含有1%血清的培养液；将加有细胞的小室放置于孵育箱继续培养24 h后，弃上室的培养基，用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定20 min；然后加入1%结晶紫染色液，37 ℃染色30 min；PBS洗涤2～3次，在显微镜下拍照。每组细胞均设3个重复孔，每孔随机取 6个视野进行拍照。

1.8 Western blot检测VSMCs中SIRT1、p53、p21及p-AMPK蛋白表达细胞裂解提蛋白，BCA法蛋白定量。SDS-PAGE电泳、转膜、8%的脱脂牛奶封闭2 h，结合一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。洗膜，结合二抗(1 ∶5 000)，室温孵育2 h。洗膜，ECL化学发光于曝光仪下检测。使用ImageJ软件分析条带灰度，以β-actin为内参计算目的条带的相对表达量。

2 结果

2.1 吴茱萸次碱对Ang Ⅱ 诱导的血管平滑肌细胞衰老和ROS生成的影响SA-β-Gal染色显示(Fig 1A和C)，1 μmol·L-1Ang Ⅱ处理细胞72 h可明显增加衰老阳性染色(蓝染)细胞数量(P<0.01)，不同剂量的Rut能剂量依赖性地降低衰老染色细胞数量，其中3 μmol·L-1Rut的效果最为明显(P<0.01)，CAPZ可消除Rut这一作用(P<0.01)。ROS结果表明(Fig 1B和D)，与对照组相比，Ang Ⅱ显著性地升高细胞内ROS水平，不同剂量的Rut呈剂量依赖性地减少ROS产生，且提前加入CAPZ可消除Rut这一作用(P<0.01)。

2.2 吴茱萸次碱对Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响Transwell结果显示，与Con组相比，1 μmol·L-1Ang Ⅱ可明显增加迁移到小室对侧的VSMC细胞数目(P<0.01)，Rut可剂量依赖性抑制Ang Ⅱ引起的VSMCs迁移(P<0.01)，预先加入CAPZ可消除Rut的作用(P<0.01)。划痕愈合实验也证实，划痕24 h后Ang Ⅱ组细胞的划痕距离明显减小(P<0.01)，而加入不同剂量的Rut后细胞划痕距离依次增宽，CAPZ可消除Rut的效应(P<0.01)，见Fig 2。

2.3 Rut对VSMC中长寿蛋白SIRT1及下游衰老通路p53/p21的影响Western blot结果表示，1 μmol·L-1Ang Ⅱ孵育VSMCs 72 h可显著降低SIRT1的表达，同时使p53和p21的表达升高(P<0.01)。不同剂量的Rut呈剂量依赖性恢复SIRT1的表达，并抑制Ang Ⅱ诱导的p53和p21表达上调，高剂量Rut(3 μmol·L-1)效果最明显(P<0.01)。提前加入CAPZ可消除或削弱Rut对这些蛋白的调节效应，见Fig 3。

Fig 1 Rut inhibited premature senescence of VSMCs and ROS production induced by Ang n=6)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ+ Rut (3 μmol·L-1)group.

2.4 TRPV1/AMPK通路介导吴茱萸次碱上调SIRT1表达的作用如Fig 4A和B所示，提前给予Compound C(AMPK抑制剂)能消除3 μmol·L-1Rut上调SIRT1的作用(P<0.01)。结果进一步证实(Fig 4C和D)，与对照组相比，Ang Ⅱ可明显减少p-AMPK水平(P<0.01)，Rut剂量依赖性地恢复p-AMPK的水平，提前加入CAPZ可部分消除Rut的这一作用(P<0.01)。

Fig 2 Effects of Rut on migration of VSMCs induced by Ang n=6)**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ+Rut(3 μmol·L-1)group.

Fig 3 Rut regulated expression of SIRT1,p53 and p21 in VSMCs treated by Ang Ⅱ via activation of **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;+P<0.05,++P<0.01 vs Ang Ⅱ+Rut (3 μmol·L-1)group.

Fig 4 Involvement of TRPV1/AMPK pathway in regulation effects of Rut on SIRT1 n=6)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ +Rut (3 μmol·L-1)group.

3 讨论

我国传统中药吴茱萸在临床用于治疗心血管疾病已有近百年历史，其主要成分Rut不仅能舒张血管产生降压效应[10]，还可抑制VSMC增殖和表型转换，从而抑制血管重构。近年来VSMC衰老在高血压等疾病相关的血管老化中的作用日益收到重视，本研究进一步在Ang Ⅱ诱导的VSMC衰老模型观察Rut的保护作用。SA-β-Gal染色是检测细胞衰老的有效方法，衰老的细胞胞质内会生成大量蓝色物质。结果显示，加入1 μmol·L-1Ang Ⅱ到VSMC72 d可显著增加蓝染的衰老细胞数量，而预先给予吴茱萸次碱则可明显减少衰老细胞。细胞衰老往往伴随氧化应激反应增强，而产生过多的ROS又可进一步促进细胞发生衰老。本研究采用DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平发现，Rut在抑制Ang Ⅱ引起的VSMC 衰老同时还明显抑制ROS生成。Rut的这一抗氧化效应在心肌细胞和单核细胞也有报道[11-12]。随年龄增长，VSMC的迁移能力也随之增强，从中膜迁移至内膜而导致血管壁重构，而Ang Ⅱ是促进这种衰老相关VSMC迁移的重要因素。本研究通过划痕愈合和Transwell实验进一步证实Rut还可明显抑制Ang Ⅱ引起的VSMC迁移。这些结果表明，Rut可显著抑制Ang Ⅱ引起的VSMC衰老和相关功能改变。

大量证据表明，SIRT1参与调节VSMC功能，被认为是药物抑制VSMC衰老的重要靶点。在Ang Ⅱ引起的高血压小鼠发现，SIRT1水平降低，而VSMC高表达SIRT1可降低血压，减轻由Ang Ⅱ引起的血管重构，抑制ROS生成和血管炎症。二甲双胍、白藜芦醇等SIRT1激活剂则可抑制Ang Ⅱ、高糖和动脉粥样硬化等因素诱导的VSMC衰老和功能紊乱[13]。文献报道SIRT1的抗衰老机制与抑制p53/p21有关[1]。SIRT1使p53乙酰化从而抑制其转录活性。p53是一种重要的衰老调节因子，能激活其下游基因p21，促进细胞衰老。p21是细胞周期依赖性激酶的广谱阻滞剂，能抑制细胞周期依赖性激酶(CDKs)，阻止细胞从G1期进入S期和G2/M期。它被认为是细胞衰老的标志。此外，有证据表明SIRT1水平改变还可影响VSMC的迁移。Ox-LDL引起的VSMC源性的泡沫细胞迁移，与SIRT1水平降低有关，过表达SIRT1则可显著抑制VSMC的迁移和侵入[14]，而白藜芦醇和辣椒素等药物可通过上调SIRT1水平可抑制VSMC迁移[15]。本研究结果表明，Ang Ⅱ可抑制SIRT1的表达，升高p53和p21的表达，不同剂量的Rut可剂量依赖性地恢复SIRT1的表达，同时抑制其下游p53和p21的表达上调。这些结果提示，Rut抗VSMC衰老和迁移作用与上调长寿蛋白SIRT1表达有关。

许多证据表明，Rut是TRPV1的激动剂[16]，Rut的降压和抑制血管重构效应均与激活TRPV1有关[10]。本研究发现，预先给予TRPV1选择性抑制剂CAPZ可取消Rut上调SIRT1表达及抑制Ang Ⅱ诱导的VSMC衰老效应，表明TRPV1介导了Rut上调SIRT1的抗衰老作用。在Ox-LDL引起的VSMC源性泡沫细胞和前脂肪细胞中，TRPV1激动剂辣椒素能上调SIRT1的表达[14]，提示TRPV1可能是调节SIRT1的重要靶点，但具体机制尚未阐明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是维持细胞能量平衡的关键分子，是SIRT1的上游分子而调节其活性。运动、能量限制、及AMPK激活剂白藜芦醇等可均通过激活AMPK升高SIRT1的表达[17]。有研究报道，TRPV1引起的一些作用与AMPK途径有关[18]，如TRPV1的激动剂辣椒素引发的VSMC自噬和脂肪细胞的褐化效应，与促进p-AMPK相关[9]。激活TRPV1后可促进细胞内钙生成，细胞内钙通过CaMKII途径激活AMPK。本研究发现，AMPK抑制剂Compound C可消除Rut上调SIRT1表达的作用。进一步检测AMPK的磷酸化水平发现，Ang Ⅱ可抑制p-AMPK，提前加入Rut能恢复p-AMPK水平，这一作用可被CAPZ部分取消。结果提示，Rut通过激活TRPV1促进p-AMPK，从而上调SIRT1表达。

综上所述，吴茱萸次碱可使SIRT1表达上调，抑制Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老和迁移，其机制涉及激活TRPV1/AMPK信号途径。