放射治疗后宫颈癌组织内差异表达基因鉴定

白 静，刘 娜，丁 力，雷 丽，倪 瑞，闫少春，邵 国

(1.包头市肿瘤医院 放射治疗科，内蒙古 包头 014030； 2.包头医学院 内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室，内蒙古 包头 014060; 3.首都医科大学 宣武医院 低氧适应转化医学北京重点实验室，北京 100053；4.包头医学院第二附属医院 内蒙古自治区消化疾病研究所 检验科，内蒙古 包头 014030)

宫颈癌(cervical cancer)是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，是全球范围内65岁以上女性第二常见肿瘤[1-2]，也是导致妇女死亡的重要原因。近些年随着放疗技术不断更新、同期放化疗方案的使用及靶向药在宫颈癌肿瘤治疗中的使用，使宫颈癌患者治疗的有效率提高，生存期延长，但是相同病理类型和不同病理类型的宫颈癌给予相同放疗剂量疗效仍存在差异，相同病理类型和不同病理类型间放射敏感性存在差异，存在放射抗拒，肿瘤放射抗拒仍是影响肿瘤放射治疗疗效的重要因素[3]。

高通量测序又被称为二代测序(next generation sequencing,NGS)，已被作为一种有效的工具，用于筛选和鉴定通过转录组测序发现的可能的疾病治疗的潜在靶点[4]。 本研究利用放射治疗宫颈癌，外照射结合近距离照射宫颈癌组织，通过高通量测序找出差异表达的基因，利用生物信息学对数据进行分析，并通过实验进行部分验证，以期为宫颈癌的放射治疗及放射抗拒分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：Trizol、反转录试剂盒、蛋白BCA定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；GADD45A，GADD45B和GADD45G抗体(Abcam公司)；鼠β-肌动蛋白(β-actin)抗体(三塔生物科技公司)；PVDF膜(罗氏生物科技有限公司)；引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.2 宫颈癌样本：收集2018—2019年在包头市肿瘤医院进行放射治疗的16例宫颈癌样本。本研究经患者签署知情同意书并由医院伦理委员会批准(批准文号：20180307)。

1.2 方法

1.2.1 样本的分组及照射：每一例患者都给予相同的放疗模式：全盆腔外照射结合腔内近距离治疗，全盆外照射总剂量45戈瑞(Gray,Gy)/25次(frequency，f)；腔内近距离治疗5～6 Gy /次(f),共治疗5～6次(f)。每一例患者的3组样本分别为外照射结合近距离治疗前(before)、治疗中(近距离治疗3次，three)和治疗结束(after)留取标本。

1.2.2 宫颈癌放射治疗的生物信息学分析:近距离治疗前、治疗3次后和治疗结束后3组样本送上海美吉生物医药科技有限公司进行mRNA表达的高通量测序，差异表达结果在美吉生物云平台(cloud.majorbio.com)进行生物信息学分析。

1.2.3 Real-time PCR 检测GADD45 mRNA水平:取50mg宫颈癌样本组织，使用Trizol法提取总RNA，并使用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit将其反转录成cDNA，使用ABI 7900实时荧光定量PCR仪和SYBR染料法检测各组GADD45和β-actin mRNA情况，根据2-△△Ct计算相对表达量。引物序列如下：GADD45-A上游引物：5′-GAGAGCAGAAGACCGAAAGGA，下游引物：5′-CAGTGATCGTGCGCTGACT-3′；GADD45-B上游引物：5′-TACGAGTCGGCCAAGTTGATG-3′，下游引物：5′-GGATGAGCGTGAAGTGGATTT-3′；GADD45-G上游引物：5′-CAGATCCATTTTACGCTGATCCA-3′，下游引物：5′-TCCTCGCAAAACAGGCTGAG-3′；β-actin上游引物：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，下游引物：5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′。

1.2.4 免疫印迹检测GADD45蛋白水平:使用RIPA裂解液提取总蛋白质，使用BCA法检测蛋白质浓度，每组蛋白样品取10 μg加入聚丙烯酰胺凝胶各泳道中，5%浓缩胶19 mA电泳30 min，12%分离胶29 mA电泳3 h后，使用转膜仪400 mA转膜过夜将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，5%牛奶封闭1 h，将GADD45A、GADD45B、GADD45G和β-actin一抗1∶1 000稀释，4 ℃过夜孵育，TBST清洗3次，山羊抗鼠/驴抗兔二抗1∶1 000稀释孵育1 h，加入ECL发光并使用化学发光仪采集图像[5]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 放射治疗宫颈癌的生物信息学分析

治疗中(three)组和治疗后(after)组与治疗前(before)组，差异表达的基因超过15 000个(图1)。而具体分析表达量高于1的基因，治疗中(three)组和治疗后(after)组与治疗前(before)组相比上调基因在6 500以上，下调基因都在100个以下(图2)，放射治疗的主要作用体现为上调基因表达。将放射治疗前(before)、治疗中(three)组与治疗后(after)差异表达的基因进行GO分析(图3)，差异表达基因主要集中在整体基因组核酸切除修复，整合素调节的细胞黏附，血管重塑，间充质细胞增殖，等等。

图1 内放射治疗宫颈癌前(before)，治疗3次(three)和治疗后(after)基因差异表达Venn图Fig 1 Venn diagram analysis of differentially expressed genes in cervical cancer specimen collected before, after and three times radiotherapy treatment

图2 内照射治疗宫颈癌前(before)，内照射治疗3次(three)和治疗后(after)基因差异表达两两比较火山图Fig 2 Volcano plots demonstrating differentially expressed genes in cervical cancer specimen collected before,after and three months radiotherapy treatment

图3 外照射结合内照射治疗宫颈癌前(before)，外照射结合内照射治疗3次(three)和外照射结合内照射治疗结束后(after)基因差异表达GO富集分析图Fig 3 GO enrichment analysis differentially expressed genes in cervical cancer specimen collected before,after and three months radiotherapy treatment.

2.2 放射治疗增加DNA损伤修复基因表达

对3组差异表达的基因根据GO分析结果，将与DNA损伤修复的基因进行列表发现three/before的比值：3～19，而last/before的比值：2.2～9，three/last的比值：0.8～3.6。因此外照射结合内照射治疗上调DNA损伤修复基因的表达，治疗结束后表达会下调(表1)。

表1 差异表达的13个DNA损伤相关基因表Table 1 13 differentially expressed genes related to DNA damage

2.3 放射治疗对宫颈癌组织GADD45表达的影响

内照射治疗3次组(three)和治疗后组(after)、治疗前组(before)相比，GADD45α，β和γ的mRNA的相对丰度增加(P<0.05)；治疗后组(after)与内照射治疗3次组(three)相比，GADD45α，β和γ的mRNA的相对丰度降低(P<0.05)。

内照射治疗3次组(three)与内照射治疗前组(before)相比，GADD45α，β和γ的蛋白的相对丰度增加(P<0.05)；治疗后组(after)与内照射治疗治疗前(before)相比，GADD45α和β的蛋白表达增加(P<0.05)(表2，图4)。

表2 放射治疗对GADD45 mRNA和蛋白表达的影响Table 2 The effect of radiotherapy on the expressions of GADD45 mRNA and

图4 Western blot检测内照射治疗宫颈癌前(before)，内照射治疗3次(three)和治疗后(after)GADD45α，β和γ基因表达水平检测Fig 4 Western blot detecting the expression of GADD45α，β and γ in cervical cancer specimen collected before,after and three months radiotherapy treatment(n=6)

3 讨论

宫颈癌(cervical cancer，CC)是女性中常见癌，2020年全球每年共有52万多例新病例和26万多例死亡病例[6]，中国女性宫颈癌约占世界新发病例的30%[7]。放射治疗(radiation therapy，RT)和手术是宫颈癌的主要治疗方式，其中放射治疗可以杀死肿瘤细胞，使肿瘤的体积缩小，有效控制肿瘤[8]。利用生物信息学可间接估计靶组织对放射治疗的敏感性[9]，而二代测序技术结合生物信息学可作为宫颈癌前体的有前景的筛选技术[10]。本研究主要通过生物信息学讨论放射治疗宫颈癌对宫颈癌组织基因表达的影响。

本研究利用生物信息学发现DNA损伤诱导基因在近距离内照射治疗3次后表达增加，其中对生长阻滞和DNA损伤诱导基因45(The Growth Arrest and DNA Damage-inducible 45，Gadd45)3种蛋白，即GADD45α，β和γ在核酸水平和蛋白水平进行了验证：近距离治疗3次之后表达增加，治疗全部结束后较治疗前水平增加但较近距离治疗3次后表达大部分降低(11/13)。DNA损伤后，所有GADD45蛋白家族成员均被迅速诱导，导致细胞周期停滞和/或凋亡，或者它们积极参与DNA修复机制。 由于GADD45蛋白与癌的发生和发展有关，因此被广泛研究[11]。GADD45α、GADD45β和 GADD45γ是GADD45成员，它们是细胞周期、衰老、存活和凋亡的调节蛋白。Gadd45蛋白促进活性DNA去甲基化，从而介导基因激活。从机制上讲，Gadd45充当基因特异性位点的DNA修复因子的衔接子，以促进DNA去除5-甲基胞嘧啶[12-14]。 因此，Gadd45是DNA修复与表观遗传基因调控之间的纽带。

本研究通过生物学信息学发现宫颈癌接受外照射结合内照射治疗可以显著改变包括GADD45在内的多种基因的表达。实验验证GADD45的变化与生物信息学分析结果一致。有报道显示GADD45放射诱导表达降低的患者其放射治疗效果较好[15]。而外照射结合内照射治疗是如何影响众多基因表达改变和其中的生物机制不明确，希望以后利用生物信息学进一步挖掘数据。同时，治疗发生的电离辐射导致DNA双链断裂(double-strand breaks，DSB)时才可以导致瘤细胞致死性损伤，但肿瘤细胞可以有效修复DSB，肿瘤细胞有效修复DSB的能力明显影响放射治疗疗效。GADD45的诱导表达变化是如何影响治疗效果，需要通过以后的进一步实验找出宫颈癌放射治疗和放射耐受的作用机制，为临床宫颈癌的治疗提供潜在分子靶点。