下调lncRNA DNM3OS通过靶向miR-193a-3p增强人直肠癌细胞系SW-480的放疗敏感性

刘明胜， 陈文超， 蔡颖畅

(衢州市人民医院 肛肠外科， 浙江 衢州 324000)

直肠癌(rectal cancer)是常见恶性肿瘤，放射治疗是其重要治疗手段，联合手术治疗可提高患者总生存率[1]。寻找对新辅助治疗有预测性及整体生存有预后性的生物标志物是直肠癌新辅助治疗领域的研究热点[2]。研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)与肿瘤的进展有关，研究报道lncRNA DNM3OS在胃癌组织和细胞系中上调，可作为胃癌患者预后不良的指标；抑制DNM3OS可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[3]。DNM3OS可影响口腔癌细胞的活力和迁移[4]。DNM3OS通过调节食管鳞状细胞癌中的DNA损伤反应而赋予放射抗性[5]。然而DNM3OS在直肠癌中的作用及其是否影响直肠癌SW-480的放射敏感性目前还尚未清楚。生物学在线软件预测发现DNM3OS与miR-193a-3p有结合位点。研究报道miR-193a-3p在直肠癌患者治疗前血浆样品中显著下调[6]。miR-193a-3p过表达可抑制结直肠癌细胞HT-29的增殖，迁移[7]。本实验旨在研究lncRNA DNM3OS对直肠癌细胞的增殖、凋亡及放射敏感性的影响及其机制是否与miR-193a-3p有关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本: 2015年6月至2020年6月衢州市人民医院收治的具有完整临床病理资料的直肠癌患者30例，全部患者经病理检查确诊，通过手术切除其癌组织和癌旁组织；患者均知情且签署知情同意书。本实验经本院伦理委员会审查批准(批准文号：院字0122019)。

1.1.2 细胞与试剂：人直肠癌细胞系SW-480(ATCC)；RPMI-1640完全培养基(Gibco公司)；荧光定量PCR试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒(日本同仁研究所)；凋亡检测试剂盒(艾美捷科技有限公司)；蛋白裂解液(上海源叶生物科技有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(AAT Bioquest公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组： SW-480细胞用RPMI-1640完全培养基培养，取对数生长期细胞，将DNM3OS干扰表达载体及阴性对照、miR-193a-3p模拟物及阴性对照转染至SW-480细胞中，记为si-DNM3OS组、si-NC组、miR-193a-3p组、miR-NC组；将DNM3OS干扰表达载体分别与miR-193a-3p抑制剂阴性对照共转染至SW-480细胞中，记为si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p组、si-DNM3OS+anti-miR-NC组。si-NC组、si-DNM3OS组、miR-NC组、miR-193a-3p组、si-DNM3OS+anti-miR-NC组、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p组细胞分别用4 Gy的射线照射后，记为4 Gy+si-NC组、4 Gy+si-DNM3OS组、4 Gy+miR-NC组、4 Gy+miR-193a-3p组、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC组、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p组。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测DNM3OS和miR-193a-3p的表达水平：提取组织和细胞RNA，按试剂盒说明进行PCR，以GAPDH和U6为内参，用2-△△Ct法计算相对表达量。DNM3OS上游引物序列：5′-CAAGGCTCTCACTTGTCCTG-3′，下游引物序列：5′-CAGCTGGAAACTGACCAAAG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游引物序列：5′-ACCTGGTCCTCAGTGTAGCC-3′；miR-193a-3p上游引物序列：5′-AACTGGCCTAC AAAGTCCCAGT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTG TCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGC AGCACATATAC-3′，下游引物序列：5′-AAAATATGG AACGCTTCACGA-3′。

1.2.3 细胞集落形成实验检测细胞放射敏感性： si-NC组、si-DNM3OS组、miR-NC组、miR-193a-3p组、si-DNM3OS+anti-miR-NC组、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p组细胞接种于60 mm的培养皿中，分别给予0、2、4、6、8 Gy的射线照射，照射后继续培养2周，吉姆萨染色后在光学显微镜下计数大于50个细胞的集落。采用GraghPad Prism5拟合细胞存活曲线。

1.2.4 MTT检测细胞增殖抑制率： 细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，加入MTT溶液和二甲基亚砜，酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值。增殖抑制率=1-A实验组值/A空白组值×100%。

1.2.5 流式细胞测量术检测细胞凋亡： 收集各组细胞，漂洗后按试剂盒说明操作，加入Annexin V-FITC和PI，孵育后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 Western blot法检测蛋白表达： 提取各组细胞总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过转膜封闭，然后加入一抗在4 ℃的冰箱中过夜；加入二抗室温孵育2 h，显影，成像，分析蛋白条带灰度值。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验：将DNM3OS的野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC和miR-193a-3p共转染至SW-480细胞中，按说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直肠癌组织中的表达

直肠癌组织中DNM3OS表达水平高于癌旁组织，miR-193a-3p表达水平低于癌旁组织(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with adjacent tissues图1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直肠癌组织中的表达Fig 1 Expression of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p

2.2 抑制lncRNA DNM3OS表达对直肠癌SW-480细胞放射敏感性的影响

与si-NC组比较，si-DNM3OS组DNM3OS表达水平降低(0.39±0.03比1.01±0.04，t=12.225，P<0.05)；不同剂量射线照射后si-DNM3OS组细胞存活分数降低(P<0.05)，其放射增敏比为1.798(图2)。

*P<0.05 compared with si-NC group图2 抑制lncRNA DNM3OS表达对直肠癌SW-480细胞存活分数的影响Fig 2 Effect of inhibiting the expression of lncRNA DNM3OS on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.3 抑制lncRNA DNM3OS表达联合4Gy照射对直肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响

si-DNM3OS组SW-480细胞增殖抑制率和凋亡率高于si-NC组，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表达水平低于si-NC组，p21、Bax、cleaved-caspase-3表达水平高于si-NC组(P<0.05)；4 Gy+si-DNM3OS组细胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+si-NC组，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表达水平低于4 Gy+si-NC组，p21、Bax、cleaved-caspase-3表达水平高于4 Gy+si-NC组(P<0.05)(图3)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with si-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+si-NC group图3 抑制lncRNA DNM3OS表达联合4 Gy照射对直肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响Fig 3 Effect of inhibition of lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.4 lncRNA DNM3OS靶向调控miR-193a-3p的表达

Starbase预测显示lncRNA DNM3OS与miR-193a-3p有结合位点(图4A)。WT-DNM3OS与miR-193a-3p共转染后的SW-480细胞荧光素酶活性低于与miR-NC共转染的细胞(P<0.05)(图4B)。过表达DNM3OS，miR-193a-3p表达水平降低；抑制DNM3OS表达，miR-193a-3p表达水平升高(P<0.05)(图4C)。

A.binding site of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p; B.cellular luciferase activity; C.lncRNA DNM3OS regulates the expression of miR-193a-3p; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with pcDNA group; ▲P<0.05 compared with si-NC group图4 lncRNA DNM3OS靶向调控miR-193a-3p的表达Fig 4 lncRNA DNM3OS targeting regulated the expression of

2.5 过表达miR-193a-3p对直肠癌SW-480细胞放射敏感性的影响

与miR-NC组比较，miR-193a-3p组miR-193a-3p表达水平升高(2.85±0.14比1.01±0.04，t=12.601，P<0.05)，不同剂量射线照射后miR-193a-3p组细胞存活分数降低(P<0.05)，细胞放射增敏比为1.701(图5)。

*P<0.05 compared with miR-NC图5 过表达miR-193a-3p对直肠癌SW-480细胞存活分数的影响Fig 5 Effect of over-expression of miR-193a-3p on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.6 过表达miR-193a-3p联合4 Gy照射对直肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响

miR-193a-3p组细胞增殖抑制率和凋亡率高于miR-NC组，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表达水平低于miR-NC组，p21、Bax、cleaved-caspase-3表达水平高于miR-NC组(P<0.05)；4 Gy+miR-193a-3p组细胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+miR-NC组，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表达水平低于4 Gy+miR-NC组，p21、Bax、cleaved-caspase-3表达水平高于4 Gy+miR-NC组(P<0.05)(图6)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+miR-NC group图6 过表达miR-193a-3p联合4 Gy照射对直肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响Fig 6 Effect of over-expression miR-193a-3p combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.7 干扰miR-193a-3p表达逆转了抑制lncRNA DNM3OS表达对直肠癌SW-480细胞放射敏感性的影响

不同剂量照射后si-DNM3OS+anti-miR-NC组细胞存活分数低于si-NC组，放射增敏比为1.745，si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p组细胞存活分数高于si-DNM3OS+anti-miR-NC组，放射增敏比为1.140；4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p组细胞增殖抑制率和凋亡率低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC组，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表达水平高于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC组，p21、Bax、cleaved-caspase-3表达水平低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC组(P<0.05)(图7，8)。

*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group图7 干扰miR-193a-3p表达逆转了抑制lncRNA DNM3OS表达对直肠癌SW-480细胞存活分数的影响Fig 7 Interfering miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

综上所述，抑制lncRNA DNM3OS表达可抑制SW-480细胞增殖，促进细胞凋亡以及增强细胞的放射敏感性，其机制可能与miR-193a-3p有关。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression;*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group图8 干扰miR-193a-3p表达逆转了抑制lncRNA DNM3OS表达联合4 Gy照射对直肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响Fig 8 Interference with miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

3 讨论

新辅助放疗是局部晚期直肠癌的标准治疗模式，但不同患者对放疗的反应不同，因此，提高患者对其敏感性，对制定个体化的治疗策略具有重要意义[8]。研究报道lncRNA DNM3OS可促进视网膜母细胞瘤细胞增殖，迁移[9]。抑制DNM3OS表达可减少卵巢癌细胞迁移和侵袭[10]。本实验结果显示，直肠癌组织中DNM3OS表达水平升高，表明DNM3OS可能在直肠癌中起促癌作用。转染DNM3OS干扰表达载体后，细胞增殖抑制率和凋亡率升高，表明抑制DNM3OS可抑制SW-480细胞的增殖，并促进细胞凋亡。转染DNM3OS干扰表达载体后并用不同剂量射线照射，结果发现细胞存活分数降低，表明抑制DNM3OS表达提高了癌细胞对放射射线的敏感性。此外，转染DNM3OS干扰表达载体并用4 Gy的射线照射后细胞增殖抑制率和凋亡率也显著升高，表明抑制DNM3OS表达的同时用射线照射对SW-480细胞的抑癌作用更强。

研究表明，miRNA也参与调控结直肠癌细胞恶性生物学行为[11]。已有研究表明，miR-193a-3p在直肠癌患者血浆中下调[6]。本实验结果显示，直肠癌组织中miR-193a-3p表达水平降低，与前人研究[6]结果相符，提示miR-193a-3p可能在直肠癌中起抑癌作用。此外，研究报道miR-193a-3p可促进鼻咽癌细胞的放射抗性[12]。本实验结果显示，单独过表达miR-193a-3p或用射线照射，SW-480细胞增殖抑制率和凋亡率升高，且不同剂量射线照射后，细胞存活分数降低；表明过表达miR-193a-3p可抑制SW-480细胞增殖，促进细胞凋亡，且可增加细胞的放射敏感性。本实验还发现，DNM3OS靶向调控miR-193a-3p，干扰miR-193a-3p表达逆转了抑制lncRNA DNM3OS表达对直肠癌SW-480细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响。