急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床常见急腹症,全球发病率呈逐年上升的趋势
。胆石症、酒精、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)是AP的三大常见病因。国内最新一项Meta分析显示,在我国,高甘油三酯血症性急性胰腺炎(hypertriglyceridemic pancreatitis,HTGP)的发生率已超过酒精性AP,成为继胆源性胰腺炎之后AP的第二大常见病因
。研究表明,合并HTG的AP患者出现重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)和器官衰竭的比率更高
。动物实验也显示HTG可加重AP大鼠胰腺组织损伤
。然而,目前HTGP的发病机制尚不明确,因此,阐明HTGP的发病机制、提出更有效的预防和治疗措施成为改善HTGP预后的关键。细胞间紧密连接(tight junctions,TJs)是维持上皮细胞结构与功能完整的重要超微结构,是维持黏膜屏障功能的重要因素。有研究发现,长期大量游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)刺激,能导致上皮细胞收缩,细胞间TJs减弱,脂质易于浸润,致使上皮黏膜屏障受到破坏
。本研究通过建立大鼠HTGP模型,观察胰腺病理改变、胰管上皮细胞超微结构,采用免疫组织化学法、免疫印迹法检测组织中细胞间紧密连接蛋白脂解刺激脂蛋白受体(lipolysis-stimulated lipoprotein receptor,LSR)、Tricellulin蛋白(TRIC)、ZO-1、occludin、claudin-7的表达,研究HTG对大鼠AP胰腺组织TJs蛋白的影响,进而探讨HTGP发病的特征及可能的发病机制。
1.1.1 实验动物:4周龄体质量60~80 g的SPF级健康雄性SD大鼠,购自广西医科大学实验动物中心(动物许可证号:SCXK桂2014-003)。
1.1.2 实验分组:48只SD大鼠随机分为普通饲养组和高脂饲养组,两组各24只,分别给予普通饲料及高脂饲料(82.8%普通饲料+15%猪油+2%胆固醇+0.2%胆酸钠)喂养。4周后行眶后静脉取血检测血清甘油三酯(triglyceride,TG)水平。普通饲养组进一步随机分为C组和AP组,高脂饲养组随机分为HTG组和HTGP组,每组各12只。AP组和HTGP组经腹腔注射雨蛙肽诱发AP,剂量为50 μg/kg,分7次注射,每次间隔1 h;C组和HTG组经腹腔注射同等剂量生理盐水,实验过程中无小鼠死亡。各组于造模后24 h、48 h处置大鼠,腹正中切口打开腹腔,循胃流出道方向找到十二指肠,暴露十二指肠内侧的胰腺组织,观察胰腺大体病变情况,主胰管位于胰腺组织靠近十二指肠降部位置,为一白色半透明导管自肝门延伸至十二指肠降部,分离主胰管置2%的锇酸固定液固定,取适量胰腺组织于4%多聚甲醛溶液固定,我院分离剩余胰腺组织置-80 ℃冰箱保存。本实验经我院伦理委员会批准,批号:202005011。
普通饲养大鼠血清呈清亮淡黄色,高脂饲养大鼠血清呈混浊乳糜样,普通饲养组和高酯饲养组大鼠的血清TG水平分别为(323.15±71.33)μmol/L和(537.06±142.45)μmol/L,差异有统计学意义(
<0.05)(见图1)。
该研究是对吉安(油田话)的单字调调值的第一次具体研究,通过所得的实验数据,得出结论:年青者(23岁)调类的基频整体上低于其他两位年长发音人的基频,年长者(68岁)的阳平尾端有明显的下降,不同于其他两位发音人,说明年龄差异影响到调类变化,历史上阳平有可能是个升降调,为了证明这一想法,笔者将会在另一论文中进行证明。因此,暂且认为油田方言总共有四个调类,阴平,阳平,上声和去声,入声归入阴平和去声。
正长斑岩(K1ξπ):出露于沃布滚陶勒盖、森德敖林等地,呈小岩株状产出,岩体侵入白音高老组、宝力高庙组组和安格尔音乌拉组。花岗闪长斑岩(K1 γδπ):出露于吉仁台高吉高尔高地一带,呈小岩株状产出,岩体侵入宝力高庙组和白音高老组。
C组大鼠胰腺组织镜下无明显病理改变,HTG组胰腺组织偶有轻微小叶间水肿,部分见炎症细胞浸润,HTG组病理评分高于C组,差异有统计学意义(
<0.05);AP组及HTGP组胰腺病理损伤以水肿、炎症细胞浸润为主,偶有出血,未见明显胰腺坏死,以24 h病理损伤最明显;各时点的AP组和HTGP组病理评分均显著高于C组及HTG组(
<0.05),各时点的HTGP组病理评分与相应时点的AP组间差异无统计学意义(
>0.05),但HTGP 24 h组与AP 48 h组病理评分差异有统计学意义(
<0.05)(见图2)。
镜下可见LSR、claudin-7主要表达在细胞质顶端近细胞膜处,以腺泡细胞表达显著;TRIC主要表达在细胞膜上,以胰腺导管上皮细胞表达显著;occludin主要在腺泡细胞膜处浓聚,细胞质也有较多量表达,胰腺导管上皮细胞少量表达。HTG组LSR、TRIC、occludin、claudin-7表达低于C组,其中LSR和TRIC表达差异有统计学意义(
<0.05);镜下可见AP组与HTGP组细胞膜上的TJs蛋白均明显减少,AP 24 h组LSR、TRIC、occludin、claudin-7表达均低于C组(
<0.05),HTGP 24 h组上述蛋白表达低于HTG组(
<0.05);HTGP 24 h组的LSR、TRIC、occludin、claudin-7表达低于AP 24 h组,其中LSR和TRIC在HTGP 24 h组和AP 24 h组表达差异有统计学意义(
<0.05)(见图3)。
“情”乃是人们的个人情感,是人们在某件事情发生后,判断、评价这件事情发生过程中的道德行为时的内心活动。道德情感基于个人的道德认识,显然两者关联密切、互相促进,道德行为的内在动力就是个人的道德情感。
1.2.1 胰腺组织病理学检查:胰腺组织经4%多聚甲醛固定72 h后常规行石蜡包埋、切片、HE染色,根据Van Laethem标准(见表1)
从水肿、炎症细胞浸润、腺泡坏死3个方面进行双盲胰腺病理评分。
西方文艺复兴的出现。荷兰学者伊拉斯谟(Erasmus)在给朋友的一封信中提到,欧洲将迎来一个历史上的“黄金时刻”,法国人称为“文艺复兴”,“这个复兴就是指突然而又不可逆转地使欧洲人与世界上其他人区分开来的力量。”[5]283从学术到艺术,新思想竞相迸发,文艺复兴表现出一个惊人的方面,即重修文物的行为产生了发明和开放式求知这样的非传统文化。新思想从佛罗伦萨一路传播至葡萄牙、波兰以及英国。文艺复兴的出现给西方,尤其是欧洲国家带来了文化领域的繁荣,而这种繁荣迫使15世纪的欧洲经历了两次结局不同的轴心思想的影响。与其说是新冒险的发现,倒不如说是西方的治理文明是试图扩张政治的影响力。
三、我国兽医管理体制改革的建议机构不健全、基层动物防疫体系薄弱,缺乏专业人才,法律不完善、等问题,严重影响了动物疫病防治能力和动物产品质量安全水平的提高。加之目前国际上特别是我周边国家重大动物疫病时有发生,甚至出现局部蔓延,对我国防控重大动物疫病形成较大压力。因此,改革兽医管理体制已经成为当前十分紧迫的任务。
1.2.2 免疫组织化学法检测胰腺组织LSR、TRIC、occludin、claudin-7表达量:取C组、AP 24 h组、HTG组和HTGP 24 h组胰腺石蜡切片经脱蜡、水化、枸橼酸钠溶液微波抗原修复20 min,用通用型SP-9000免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥公司)行内源性过氧化物酶阻断10 min、山羊血清封闭20 min,一抗LSR(1∶200,英国Abcam,货号:ab232780)、TRIC(1∶100,美国Sigma-Aldrich,货号:SAB1306444)、occludin(1∶1 000,武汉三鹰,货号:13409-1-AP)、claudin-7(1∶100,上海生工,货号:D151730)4 ℃孵育过夜,再予山羊抗兔IgG聚合物室温孵育15 min、HRP标记链酶卵白素常温孵育10 min、DAB显色5 min、苏木精复染1 min,脱水、透明、封片。显微镜下观察胰腺组织的染色强度及范围。每张切片随机选取5个高倍视野(放大400倍),应用Image-Pro Plus 6.0软件获取平均光密度值(
)行半定量分析。
1.2.3 主胰管上皮细胞透射电镜观察:取C组、AP 24 h组、HTG组、HTGP 24 h组大鼠主胰管组织经固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后,在透射电镜(日立H-7650)下观察主胰管上皮细胞超微结构及TJs变化。
C组及HTG组主胰管上皮细胞可见TJs、桥粒/半桥粒连接,AP 24 h组及HTGP 24 h组主胰管上皮细胞TJs较C组及HTG组减少,甚至消失,且细胞间隙明显增宽,其中HTGP 24 h组细胞间隙较AP 24 h组增宽更明显(见图4)。
TJs是由多种蛋白及分子构成的具有多种功能的大分子复合物,广泛存在于所有上皮或内皮细胞间连接的最顶端,并且具有屏障功能
。TJs包括双细胞间紧密连接(bicellular tight junctions,bTJs)和三细胞间紧密连接(tricellular tight junctions,tTJs)。bTJs主要是由occludin和claudins蛋白家族连接构成。tTJs则由TRIC和angulins蛋白家族组成。
动物研究表明,在AP时,胰腺腺泡细胞及导管上皮细胞膜occudin、claudins蛋白、ZO-1表达均减少或消失
。本研究结果与前述研究类似:occludin、claudin-7和ZO-1在胰腺炎组的表达均低于非胰腺炎组。TRIC位于三细胞连接的顶部,是维持上皮屏障的重要结构。它在正常人体胰腺腺泡和导管细胞均有定位表达,而胰岛细胞中无表达,TRIC在分化良好的胰管腺癌中过表达,但在低分化腺癌中表达较弱
。LSR,又称angulin-1,是angulins蛋白家族中发挥作用的核心蛋白,定位于三细胞连接的中心,主要作用是调控TRIC的表达,募集TRIC于三细胞连接处,维持tTJs的形态
,敲除LSR后,细胞膜上TRIC的表达也随之消失
。体外研究表明,敲除LSR后,正常人胰腺导管上皮细胞及子宫内膜细胞的上皮屏障均受到破坏,而人胰腺癌细胞及子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力明显增强
,用EGF或TGF-β治疗后可增加LSR的表达,并诱导LSR和TRIC从tTJs定位到bTJs
。正如前所述,目前关于TRIC和LSR的研究大多与肿瘤性疾病相关,而与AP相关研究极少。在本研究中,TRIC和LSR在AP状态下表达减少,与胰腺损伤程度成反比,提示可能因TRIC和LSR表达下降所致的黏膜屏障损伤而加重胰腺病理损伤。
此外,本课题组前期研究表明,HTG患者更容易出现SAP,其发生风险与血清TG水平呈正相关
,动物模型也提示HTGP大鼠胰腺病理损伤比非高脂AP更严重
。在本研究中,HTGP的胰腺损伤亦重于非高脂的AP模型。此外,本研究尚显示tTJs相关蛋白TRIC和LSR在HTGP中表达下降程度亦高于AP模型,而bTJs相关蛋白表达则无上述情况,提示在AP过程中,HTG可能通过削弱胰腺上皮细胞的TJs加重胰腺病理损伤,且该作用可能更多作用于tTJs而非bTJs。
本研究结果显示,紧密连接蛋白LSR、TRIC、ZO-1、occludin、claudin-7在HTG及HTGP大鼠胰腺组织中表达较非高脂模型下降,其中以tTJs相关蛋白LSR及TRIC下降更明显,提示AP时,HTG可能通过削弱胰腺上皮细胞TJs,尤其是tTJs加重胰腺损伤,为HTGP的治疗提供新思路。
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