mTOR在运动干预高脂膳食大鼠胰岛素抵抗形成中的作用及机制研究

刘霞　孙青　陈志军

摘 要：目的：探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在高脂膳食诱导胰岛素抵抗（IR）的形成及运动干预中的作用。方法：选用清洁级的雄性SD大鼠40只，随机分为4组：正常对照组（C组，n=10）；高脂膳食组（H，n=10）；游泳运动组（E，n=10）；高脂膳食+游泳运动组（HE，n=10）。按实验要求分别给予普通饲料和高脂饲料，E、HE组每天无负重游泳运动1小时。11周后检测各组大鼠空腹血糖（FBG）、血清胰岛素（FBG）、骨骼肌AMPK、PI3K、Akt、mTOR、S6K1的表达量。结果：1）与C组相比，H组FBG、FINS、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）均显著性升高（P<001）（P<0.05），E组FINS极显著性下降（P<0.01）；与H组相比，HE组FINS显著性下降（P<0.05）。2）与C组比较，H组骨骼肌mTOR含量和mRNA都有显著性增加（P<0.05），S6K1mRNA极显著性升高（P<0.01）；与H组比较，HE组骨骼肌mTOR、S6K1mRNA显著性减少（P<0.05）。3）与C组比较， E组骨骼肌Akt和AMPK含量显著性增加（P<0.01）；与H组比较，HE组骨骼肌PI3K、Akt、AMPK含量有增加，但均无显著性（P>0.05）。结论：1）长期的高脂膳食可激活mTOR/S6K1信号通路，导致胰岛素抵抗的发生。2）有氧运动激活AMPK，抑制mTOR的作用，AMPK/mTOR/S6K1可能在运动干预高脂膳食诱导IR形成中起着重要的作用。

关键词：高脂；胰岛素抵抗；运动干预； mTOR；AMPK

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2015）05-0057-05

Abstract：Objective：Explore the effect of mTOR on the generation of insulin resistance of high-fat diet and exercise induced.Methods：40 Sprague-Dawley（SD）male rats were randomly divided into control group（C，n=10），High-Fat Diet Rats（H，n=10），Swimming Exercise Rats（E，n=10） and High-Fat Diet+Swimming Exercise Rats（HE，n=10）.According to the acquirement， they should be fed separately normal diet and high-fat diet.Rats in group E and group HE were both asked to swim for one hour with non-weight bearing everyday.After 11weeks，measuring the content of FBG，FINS，the expression of AMPK，PI3K，Akt，mTOR，S6K1 in skeletal muscles.Results：1）Compared with group C，

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是胰岛素经典PI3K/AKT信号通路的下游靶蛋白，受营养物质、能量变化以及生长因子的激活，可调控蛋白质合成、细胞生长和增殖[1]。已有研究发现，mTOR与胰岛素抵抗（IR）的关系密切，外界信号刺激导致mTOR持续高度活化时，mTOR可通过负反馈途径引起胰岛素受体底物-1（IRS-1）丝氨酸磷酸化是IR形成的主要原因[2]。而NiuYM[3]等研究发现，mTOR/S6K1信号通路与高脂饮食诱导IR的发生有着密切的关系，有氧运动可能是通过抑制mTOR/S6K1信号通路，使IR得到改善，但其调控机制尚不清楚，为此本研究将通过高脂膳食诱导IR形成的同时进行运动干预，来进一步探讨mTOR与IR的关系以及运动对mTOR的调控机制。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物与分组

选用清洁级6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重160～180 g，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。分笼饲养，每笼5只，环境温度（25±1）℃，自然光照，每天更换一次垫料，保持笼内干燥。随机分成4组：正常对照组（C，n=10）；运动训练组（E，n=10）；高脂对照组（H，n=10）；高脂+运动训练组（HE，n=10）。高脂饲料的配方为78.8%基础饲料、10%蛋黄粉、10%猪油、1%胆固醇和0.2%胆盐[4]，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场配制。

1.2 运动训练方案

运动组（E、HE）大鼠每天进行无负重的游泳训练，每周训练6天，第1周进行适应性训练，游泳时间在1周之内过渡到60 min，正式运动训练11周。游泳池为100 cm×70 cm×60 cm长方体水桶，水深50 cm、水温（33±1）℃。在训练过程中时刻观察大鼠游泳状态防止溺水死亡或偷懒休息，并及时捞出老鼠粪便，确保泳池水质清洁。

1.3 实验取材

大鼠在末次运动后，禁食12 h，次日晨分别按50 mg/kg的剂量腹腔注射2%的戊巴比妥钠麻醉，然后腹主动脉取血3 mL，放入无菌试管中，在室温静置30 min后，4℃、3 500 rpm离心15 min，在2 h内测定空腹血糖（FBG），其余血清在-80℃冰箱中保存，以备测定空腹血清胰岛素（FINS）；取大鼠腓肠肌，立刻放入液氮中，再转入-80℃保存。然后称量约300 mg的腓肠肌浅层组织，剪碎后移入玻璃匀浆器中，加入预冷的生理盐水3 mL，在冰浴下仔细研磨制备10%的组织匀浆，并以3 000 rpm低温离心10 min，取上清液-40℃保存，以备测定骨骼肌中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶（Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和 mTOR含量；称量80～100 mg的浅层腓肠肌，用Trizol （购自Life technologies）法从骨骼肌组织中提取总RNA后，采用NanoDrop ND-3300微量分光光度计检测260/ 280吸光度比值，判断RNA纯度。按照cDNA合成试剂盒（购自上海东洋纺生物科技有限公司）中说明书上的操作步骤，使用2720 Thermal Cycler梯度PCR仪（美国）进行cDNA合成，反应结束后，在-20℃条件下保存。

1.4 指标测试

FBG采用葡萄糖氧化酶法测定，测定仪器为日立全自动生化分析仪；FINS、骨骼肌PI3K、Akt、AMPK和 mTOR采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定，试剂盒购于上海博古生物科技有限公司，测定仪器为美国产的ELX800型酶标仪；胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5。腓肠肌匀浆液中蛋白定量采用BCA法，试剂购于碧云天生物技术研究所，测试仪器为全波长酶标仪；骨骼肌mTOR、S6K1mRNA采用RT-PCR法测定。使用SYBR Green Master（ROX）试剂盒（购自Roche Diagnostics），以cDNA为模板，β-actin为内参，在ABI 7500 RT-PCR仪进行基因扩增。扩增程序为：50℃预处理2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s共进行40个循环。程序运行结束后，将目的基因的Ct值与内参GAPDH进行标准化，计算出目的基因的相对表达量。mTOR、S6K1和GAPDH的引物由均由上海生物工程有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 mTOR、S6K1和β-actin的引物序列

1.5 统计分析

实验数据均采用SPSS13.0统计软件进行处理，结果用均数±标准差（M±SD）表示，H组、E组与C组之间和HE组与H组之间分别采用独立样本t检验进行比较，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异。

2 研究结果与分析

2.1 实验大鼠FBG、FINS和HOMA-IR的变化

从表2可见，与C组相比，H组FBG极显著性升高（P<0.01），FINS和HOMA-IR均显著性升高（P<0.05）；E组FBG降低，但无显著性差异（P>0.05），FINS极显著性降低（P<0.01），HOMA-IR显著性降低（P<0.05）。与H组相比，HE组FINS有显著性下降（P<0.05），FBG和HOMA-IR有下降趋势，但没有显著性（P>0.05）。

表2 实验大鼠FBG、FINS和HOMA-IR的变化

注：H组、E组与C组相比，*，P<0.05，**，P<0.01；HE组与H组相比，#，P<0.05，##，P<0.01。

2.2 实验大鼠骨骼肌mTOR和S6K1含量的变化

从表3可见，与C组比较，H组骨骼肌mTOR含量和mRNA都有显著性增加（P<0.05），S6K1mRNA极显著性升高（P<0.01），E组骨骼肌mTOR含量无显著性差异，mTOR和S6K1mRNA显著性下降（P<005）。与H组比较，HE组骨骼肌mTOR含量有所减少，但无显著性差异（P>0.05），mTOR、S6K1mRNA显著性减少（P<0.05）

表3 实验大鼠骨骼肌mTOR蛋白、mTOR和S6K1 mRNA的变化

注：H组、E组与C组相比，*，P<0.05，**，P<0.01；HE组与H组相比，#，P<0.05，##，P<0.01。

2.3 实验大鼠骨骼肌PI3K、Akt、AMPK含量的变化

从表4可见，与C组比较，H组骨骼肌PI3K和Akt含量无显著性差异（P>0.05），E组骨骼肌PI3K含量有所增加，但无显著性差异（P>0.05），Akt含量显著性增加（P<0.01）；与H组比较，HE组骨骼肌PI3K、Akt含量有增加，但均无显著性（P>0.05）。与C组比较，E组骨骼肌AMPK含量极显著性增加（P<0.01），H组骨骼肌AMPK含量下降，但无显著性差异（P>0.05）；与H组比较，HE组骨骼肌AMPK含量有增加趋势，但无显著性（P>0.05）。

表4 实验大鼠骨骼肌PI3K、AKT、AMPK的变化

注：*与C组相比；**为P<0.01。

3 讨论

3.1 mTOR在高脂膳食大鼠骨骼肌IR形成与运动干预中的作用

与C组相比，11周高脂膳食组大鼠体重、FBG和FIns显著性升高，且HOMA-IR也显著性升高，说明高脂膳食组产生了IR。与此同时，与H组相比，HE组空腹胰岛素有显著性下降（P<0.05），空腹血糖和HOMA-IR有所下降，但没有显著性（P>0.05），说明长期的运动对高脂诱导的IR有一定的干预作用，但不足以完全改善高脂诱导的IR。

不少研究发现，mTOR/S6K1信号通路与高脂饮食诱导IR的发生有着密切的关系[3，5-6]。在正常情况下，mTOR参与机体蛋白质合成、细胞增殖、能量代谢等生理活动，但当外界信号如氨基酸过度刺激导致mTOR持续高度活化时，mTOR通过反馈性途径产生IR[5]。本研究发现，与C组比较，H组骨骼肌mTOR含量和mRNA量都有显著性增加（P<0.05），S6K1mRNA极显著性升高（P<0.01），说明高脂膳食引起的血糖和胰岛素含量的升高激活了骨骼肌mTOR/S6K1信号通路，使IRS丝氨酸过度磷酸化，从而导致胰岛素的反应性下降，诱发IR的出现。实验表明，8W的高糖高脂膳食可使大鼠产生肥胖、高FFA及炎症反应，从而成功诱导大鼠产生IR，并使脂肪组织 PI3K表达降低，P70S6K升高[6]。如将db/db小鼠肝脏S6K1基因沉默后，IR有明显的改善，特别是在空腹状态时，增强了胰岛素的信号传导，糖异生水平下降[7] 。探讨其机制，炎症及高脂等状态可使mTOR及其下游靶点S6K1活化加强有可能导致IRS-1丝氨酸磷酸化，从而抑制胰岛素的作用，引发机体产生IR[8-10]。RSK（P90核糖体S6K）能有效抑制IRS-1丝氨酸磷酸化，可能是一个新的调节IR和糖代谢的因子[11]

研究证实，有氧运动能下调mTOR/S6K1信号通路，增加骨骼肌对胰岛素的敏感性，从而改善IR[12]。WangT[13]研究认为，吴茱萸碱可能通过抑制脂肪组织mTOR-S6K信号和IRS1丝氨酸磷酸化，改善葡萄糖耐量，阻止IR的发生。但是Medeiros C[14]研究发现，运动训练能够上调饮食性肥胖大鼠心肌中mTOR/p70S6k信号途径，促进蛋白质合成。本研究进一步研究了长期有氧运动对高脂膳食大鼠骨骼肌mTOR/p70S6k信号途径的影响，结果发现，与H组比较，HE组骨骼肌mTOR和S6K1mRNA显著性下降（P<005），说明长期的有氧运动在一定程度上可下调高脂膳食大鼠骨骼肌mTOR/S6K1mRNA的表达，有效防止IR的形成。

3.2 在IR形成与运动干预中的mTOR变化的可能机制

mTOR主要受到PI3K/AKT/mTOR和LKB1/AMPK/mTOR信号通路的调控[15]。PI3K/Akt/mTOR信号通路是胰岛素重要的作用途径，胰岛素、生长因子和细胞因子等可激活PI3K，在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶（PDK）的协同作用下，导致Akt从胞浆转位到质膜，并促进Akt的磷酸化，通过mTOR、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应[16]。但当营养水平过剩时，生长因子等通过mTOR和S6K1可反馈调节PI3K的激活，导致IR。孟艳[17]实验证实，PI3K-mTOR信号通路持续激活时，可以通过下调PDGFR-IRS导致细胞胰岛素信号通路的传递阻滞，发生IR现象，这与肥胖伴发的IR和2型糖尿病有着相似的生物学基础。但本研究发现，与C组比较，11周高脂喂养的大鼠（H组）骨骼肌PI3K和Akt含量无显著性差异（P>0.05），这可能与实验方法的选择以及指标测试的方法不同有关。而长期的有氧运动对IR骨骼肌PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响，目前结果并不一致。高晶[18]实验发现，与糖尿病组比较，8周有氧运动可使骨骼肌PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均显著性增加。但Christ-Roberts等研究发现，8周的有氧运动训练并不能增加超重非糖尿病与2型糖尿病患者骨骼肌中PI3K的活性[19]。在本实验中，与C组比较，E组骨骼肌PI3K含量有所增加，但无显著性差异（P>0.05），Akt含量显著性增加（P<0.01）；与H组比较，HE组骨骼肌PI3K、Akt含量有增加，但均无显著性（P>0.05）。从而进一步说明长期的有氧运动并不能有效地提高高脂膳食大鼠骨骼肌中PI3K、Akt含量。

AMPK能够参与细胞和组织的糖脂代谢，调节机体的能量摄入和消耗。长期高脂饮食可减少肝脏组织AMPKα蛋白的磷酸化和AMPK的活性，影响体内能量代谢[20]。有研究表明，AMPK也是mTOR重要的上游调节因子。在SD大鼠血管平滑肌细胞中，AICAR激活AMPK可以显著抑制细胞内mTOR的mRNA表达，并显著抑制p-mTOR的活性[21]。Saha AK[22]在调节葡萄糖和亮氨酸诱导的IR实验中发现，AMPK可下调mTOR/p70S6K活性。电刺激引起的肌肉收缩可激活AMPK，从而减弱Akt/mTOR、S6K1、4E-BP1和eEF2的信号作用，并认为AMPK对PI3K信号通路可发挥双重作用，即激活PI3K/Akt和抑制mTOR/p70S6K[23]。AMPK激活后一方面能够直接磷酸化mTORThr2446位点而抑制其活性[24]，另一方面通过激活TSC2而间接抑制mTOR的活性[25]。运动时细胞内AMP/ADP明显升高，可激活AMPK进而抑制mTOR的活性[26]。而长期的运动训练可以使骨骼肌细胞AMPK表达水平及其活性显著升高，从而抑制mTOR的活性[27]。本实验结果发现，与C组相比，H组大鼠骨骼肌AMPK含量降低，mTOR含量和S6K1mRNA显著性升高，运动组骨骼肌AMPK含量显著性增加，高脂运动组骨骼肌mTOR和S6K1mRNA显著性下降，从而说明AMPK途径可能参与了运动对mTOR/S6K1信号通路的调节。由此推断运动刺激或能量限制引起AMPK的激活，可直接磷酸化mTOR而抑制其活性，从而减轻高脂膳食引起mTOR过度激活而形成的IR。因此，长期的高脂膳食激活mTOR可能引起胰岛素受体底物的作用减弱，从而导致IR的发生；而长期的有氧运动可激活AMPK，导致mTOR的下降，从而改善IR。

4 结论

4.1 长期的高脂膳食可激活mTOR/S6K1信号通路，导致胰岛素抵抗的发生。

4.2 有氧运动可激活AMPK，抑制mTOR的作用，AMPK/mTOR/S6K1可能在运动干预高脂膳食诱导IR形成中起着重要的作用。

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