LAG3 慢病毒质粒构建及其稳定转染细胞系的建立

刘宇轩, 黄莉莉, 杨馥旭, 方楷漪, 胡楠楠, 穆业腾, 郭 冲, 夏 薇, 关新刚

（北华大学医学技术学院医药生物工程重点实验室，吉林 吉林 132013）

淋巴细胞活化因子3 （lymphocyte activation gene 3，LAG3） 是一种属于免疫球蛋白超家族的CD4 样分子，在活化的T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和巨噬细胞等细胞上表达［1-2］。在肿瘤组织中，LAG3 在肿瘤浸润淋巴细胞表面高表达［3-4］。LAG3 的主要配体为主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（major histocompatibility complex Ⅱ，MHC Ⅱ）。肿瘤细胞表面表达的LAG3 配体分子与其结合，抑制T 淋巴细胞激活，发挥负向免疫调节功能［5-6］。WANG 等［7］研究显示： 纤维蛋白样蛋白1 （fibrinogen-like protein 1，FGL1） 是MHC Ⅱ之外的LAG3 的另一个配体。FGL1 在大多数正常组织中低表达，但是在多种肿瘤组织中呈高水平表达，且与治疗和预后有密切关联。正常生理状态下，FGL1 参与促进细胞分裂和代谢功能；肿瘤患者中阻断FGL1-LAG3 信号通路可激活T 淋巴细胞免疫抗肿瘤反应，揭示了一种新的免疫逃避机制。近年来，多项研究［8-10］显示：LAG3 在多种肿瘤中发挥免疫调节作用，包括结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌和头颈部细胞癌等。

随着对癌症免疫治疗机制研究的逐渐深入，LAG3 有望成为继程序性死亡受体1 （programmed cell death protein 1，PD-1） 和细胞毒性T 淋巴细胞抗原4 （cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4） 等免疫检查点之后的新型免疫治疗靶点。研究［11-12］显示：LAG3 单克隆抗体可以通过结合LAG3 阻断其与配体的相互作用，下调LAG3对免疫系统的抑制作用。目前已有包括Relatlimab、

RO7247669 和MGD013 在内的多种LAG3 单克隆抗体、融合蛋白及双特异性抗体进入Ⅰ期/Ⅱ期临床试验，其中已完成的Relatlimab （LAG3 抗体）Ⅲ期临床试验［13］结果显示：Relatlimab 与PD-1 抗体联用能够明显改善黑色素瘤患者的中位生存期。为了深入研究LAG3 蛋白在癌症免疫治疗中的重要作用，本研究通过构建融合mCherry 红色荧光蛋白的LAG3 慢病毒表达载体，转染获得稳定表达LAG3 的HEK293T 细胞系，为后续研究LAG3 抑制剂在癌症治疗中的作用提供重要的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器HEK293T 细胞为本实验室冻存。培养基购自美国Hyclone 公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，pEZ-mCherry 质粒购自广州易锦生物技术有限公司，pcDNA3.1-LAG3 质粒为本实验室构建，T4 DNA 连接酶、EcoR Ⅰ和NotⅠ限制性内切酶购自日本TaKaRa 公司，Lipofectamine 3000 转染试剂购自美国Invitrogen 公司，LAG3 单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG （H+L） 购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，蛋白预染Marker 和显色底物购自上海碧云天生物技术有限公司。核酸电泳系统、凝胶成像系统、蛋白电泳和转膜系统均购自美国Bio-Rad 公司，倒置荧光显微镜购自美国Lifte-Technologies 公司，全自动多功能酶标仪购自瑞士TECAN 公司。

1.2 LAG3 慢病毒质粒的构建将pEZ-mCherry载体与pcDNA3.1-LAG3 质粒同时用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ进行双酶切，37 ℃水浴4 h，酶切产物经0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离并对相关片段进行凝胶回收，采用T4 DNA 快速连接酶在25 ℃水浴连接1 h，将连接产物转化到DH5α 感受态细胞，接种至含氨苄青霉素（Amp） 的LB 平板培养基中，过夜培养。从平板培养基中挑取单个菌落，160 r·min－1摇床过夜，提取质粒。双酶切验证成功的质粒由生工生物工程（上海） 股份有限公司进行测序。

1.3 LAG3 稳定转染细胞系的建立LAG3 稳定转染细胞系通过脂质体转染及嘌呤霉素筛选获得。转染前1 d，将对数生长期的HEK293T 细胞以每孔1×106个细胞的密度接种在6 孔细胞培养板中，转染前汇合度达到70%～90%。第2 天加入含有Lipofectamine 3000 及LAG3 质粒的Opti-MEM 混合溶液，以转染空载体PEZ-mCherry 为对照，4 h 后换成新鲜配制的完全培养基，转染48 h 后在荧光显微镜下587 nm 激发光观察细胞膜上和细胞质中LAG3-mCherry 红色荧光的表达及细胞膜定位情况。为了获得稳定表达LAG3 的HEK293T 细胞系，转染48 h 后将细胞转移至10 cm 培养皿进行培养，更换为含嘌呤霉素（8 mg·L－1） 的新鲜培养基，每隔2 d 弃去原有培养基，用PBS 缓冲液清洗2 次，更换含嘌呤霉素（8 mg·L－1） 的新鲜培养基，此步骤重复3 次。在筛选细胞的细胞膜上检测到明亮的红色荧光提示稳定转染细胞初步制备成功。

1.4 LAG3 蛋白表达验证通过Western blotting法验证稳定转染细胞中LAG3 蛋白表达情况。筛选结束后收集细胞，PBS 缓冲液清洗2～3 次，用RIPA 裂解液冰上裂解60 min，每隔10 min 颠倒混匀，之后将裂解液经12 000 g、 4 ℃离心30 min，取上清进行BCA 蛋白定量及SDS-PAGE 分析。取30 μg 总蛋白经12% SDS-PAGE 凝胶分离，25 V恒压14 min 转移到PVDF 膜上。PVDF 膜用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h 后，分别与LAG3一抗（1∶1 000） 和β -actin 一抗（1∶1 000） 在4 ℃摇床孵育过夜。TBST 清洗3 次后，再与辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000） 室温孵育2 h，洗涤3 次后，将ECL 化学发光试剂盒（BeyoECL Star） 中的A 液和B 液按1∶1 比例混合，覆盖到膜上，使用化学发光型凝胶成像系统（MicroChemi 4.2）进行显影成像。若在相对分子质量为72 000 附近出现特异性条带则提示LAG3-mCherry 融合蛋白表达成功。

2 结 果

2.1 LAG3 慢病毒质粒的构建含有mCherry 红色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pEZ-mCherry 和LAG3 质粒（pcDNA3.1-LAG3） 分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ进行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测到长度约为8 012 bp 的载体片段和2 066 bp 的目的基因片段（图1）。将载体片段和目的片段凝胶回收，连接产物转化，提取重组质粒后EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切鉴定结果显示：重组质粒双酶切后可见长度约为8 012 和2 066 bp 的2 条DNA 条带，与pEZ-mCherry载体和LAG3基因片段大小相符（图2），提示重组质粒pEZ-LAG3-mCherry构建成功。

图1 LAG3 质粒和mCherry 慢病毒表达载体双酶切鉴定Fig.1 Double digestion of LAG3 plasmid and mCherry lentiviral expression vector

图2 重组质粒pEZ-LAG3-mCherry 的双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pEZLAG3-mCherry by double digestion

2.2 LAG3-mCherry 重组质粒的DNA 序列测定

重组质粒pEZ-LAG3-mCherry DNA 测序结果显示：LAG3 基因成功插入到pEZ-mCherry 载体中的EcoR Ⅰ位点（GAATTC），提示LAG3-mCherry重组质粒pEZ-LAG3-mCherry 构建成功。见图3。

图3 重组质粒pEZ-LAG3-mCherry 的DNA 测序结果Fig.3 DNA sequencing results of recombinant plasmid pEZ-LAG3-mCherry

2.3 LAG3-mCherry 在HEK-293T 细胞中的定位利用Lipofectamine 3000 转染试剂将重组质粒pEZ-LAG3-mCherry 转染HEK-293T 细胞，转染48 h 后在荧光显微镜下观察红色荧光（图4），红色荧光主要分布在HEK-293T 细胞的细胞膜上，在细胞质中也有少量分布，与参文［14］ 报道的LAG3基因作为细胞膜受体定位相符。

图4 LAG3-mCherry 在HEK293T 细胞中的定位（Bar=20 μm）Fig.4 Location of LAG3-mCherry in HEK293T cells (Bar=20 μm)

2.4 LAG3-mCherry 蛋白表达验证LAG3-mCherry 重组质粒转染HEK-293T 细胞后，经过嘌呤霉素筛选得到稳定表达LAG3-mCherry 的细胞系。提取稳定表达细胞系的总蛋白，采用Western blotting 法检测LAG3 蛋白表达情况：转染LAG3-mCherry 重组质粒的细胞裂解液泳道中在相对分子质量72 000 附近检测到清晰单一条带，与预计相对分子质量相符；而转染空载体的细胞裂解液泳道中未检出条带，提示LAG3-mCherry 融合蛋白在制备的稳定表达细胞系中成功表达。见图5。

图5 Western blotting 法检测HEK293T 细胞中LAG3-mCherry 蛋白表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expression of LAG3-mCherry in HEK293T cells detected by Western blotting method

3 讨 论

免疫检查点是一类免疫细胞上表达的负性调节功能的受体分子，能够抑制T 淋巴细胞的过度激活发挥防止发生自身损伤［15］。肿瘤细胞通过表达免疫检查点的配体从而逃避免疫系统的识别和杀伤，因此基于免疫检查点阻断策略的药物研发成为了肿瘤免疫治疗的热点领域［16］。目前已经发现的免疫检查点主要包括PD-1、CTLA-4、LAG3 和T 细胞免疫球蛋白黏蛋白3 （T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3） 等［17-18］。现在已有多款基于PD-1、 PD-L1 和CTLA-4 检查点的单克隆抗体被批准用于临床多种癌症治疗并取得了前所未有的治疗效果。基于其他免疫检查点的单克隆抗体也相继进入临床试验，有望获得批准用于临床相关癌症的治疗。

研究［17］显示：肿瘤细胞诱导的T 淋巴细胞衰竭是其逃逸免疫攻击的重要因素之一。阻断免疫检查点分子介导的抑制性信号通路能够激活抗肿瘤免疫应答［18］。肿瘤发生发展过程中，长期抗原刺激会促使LAG3 基因呈高水平表达［16，19］，诱导T 淋巴细胞衰竭，封闭LAG3 能够促进T 细胞增殖并提高有关细胞因子的分泌［20］。WOO 等［21］在小鼠肿瘤模型上检测到肿瘤浸润淋巴细胞上LAG3 和PD-1 的共表达，同时阻断LAG3/PD-1 能够抑制小鼠结肠癌细胞的生长，并消除80% 的肿瘤。开发LAG3 免疫抑制信号的特异性阻断药物具有广阔的临床应用前景。

mCherry 作为一种示踪荧光蛋白，具有较高的激发态、较低的光毒性和较强的组织穿透性，因此在细胞分布研究领域得到了广泛应用［22］。由于HEK293T 细胞生长繁殖速度快，极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染［23-27］，因此本实验选择HEK293T 细胞作为转染并观察蛋白表达的对象。本研究成功构建了LAG3-mCherry 慢病毒表达载体，在荧光显微镜下观察到LAG3 基因主要在转染细胞的细胞膜上分布，Western blotting 法检测证实了LAG3 蛋白的成功表达。

综上所述，本研究成功构建了LAG3-mCherry的慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry，建立了LAG3-mCherry 稳定表达的HEK293T 细胞系，为进一步研究LAG3 基因功能及其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。