长链非编码RNA ELFN1-AS1在结直肠癌患者血清中的表达及临床意义*

董利阳，徐小卫，郑婷婷，刘佳梦，毛朝明

江苏大学附属医院核医学科，江苏镇江 212002

2018年全球肿瘤流行病学调查显示，结直肠癌的发病率在全球恶性肿瘤中排第3位，在肿瘤病死率中排第2位[1]。研究表明，结直肠癌患者的生存率与疾病分期明显相关，Ⅰ～Ⅱ期患者的整体生存率约为90%，Ⅲ期约为71%，Ⅳ期约为14%[2]。显然，早期发现对提高结直肠癌患者的整体生存率具有重要的临床意义。长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt且蛋白质编码能力有限的RNA。研究发现，lncRNA在多种类型的肿瘤组织中表达异常，且影响肿瘤的发生、癌变和转移[3]。lncRNA亦在血液样品中稳定表达，显示出作为新型肿瘤标志物的潜能，而将循环lncRNA作为癌症诊断的标志物已在肺癌、肝癌、乳腺癌中被报道[4]。lncRNA ELFN1-AS1是一种新近发现的lncRNA，位于ELFN1基因的反义位置[5]。GEPIA数据库分析发现，结直肠癌患者结肠病灶中lncRNA ELFN1-AS1高表达，并与患者总生存率降低密切相关[6]。笔者先前对22例结直肠癌患者结肠和其邻近组织中lncRNA ELFN1-AS1测定时发现，lncRNA ELFN1-AS1水平在结直肠癌组织中明显升高。体外细胞实验发现，ELNF1-AS1的敲除明显抑制了结直肠癌细胞株的生长和迁移，提示lncRNA ELFN1-AS1失调在结直肠癌发展中发挥关键作用[7]。本研究旨在探究lncRNA ELFN1-AS1在结直肠癌患者血清中的表达及临床意义，以期为结直肠癌的早期诊断提供新策略。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年9月至2021年2月于本院胃肠外科和肿瘤科诊治的结直肠癌患者50例作为结直肠癌组。纳入标准：(1)病理学检查明确诊断；(2)为初次诊治，无放疗、化疗及靶向抗癌治疗史。排除标准：(1)合并其他肿瘤；(2)既往有结直肠肿瘤史，并接受抗肿瘤治疗；(3)患有精神疾病或存在严重的心、肝、肺等其他重要脏器疾病。收集同期本院体检健康者40例作为对照组。结直肠癌组男30例，女20例；年龄<60岁患者17例，≥60岁33例。对照组男25例，女15例；年龄<60岁13例，≥60岁27例。结直肠癌组和对照组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究通过本院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2仪器与试剂 MolPure®Blood RNA提取试剂盒(上海YEASEN公司)，lncRNA ELFN1-AS1及18S real-time PCR引物(广州复能基因公司)，All-in-one First-Strand cDNA Synthesis反转录试剂盒及All-in-oneTMqPCR Mix实时荧光定量试剂盒(广州复能基因公司)，NnoDrop ONE微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)，普通PCR仪(美国Bio-Rad公司)，QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 采集所有研究对象的空腹静脉血5 mL(结直肠癌患者于手术前采集，体检健康者于体检时采集)，置于含促凝胶的真空采血管中，2 000 r/min离心10 min，吸取上层血清置于无RNAse的1.5 mL EP管中并于-80 ℃冰箱保存备用。同时获取结直肠癌患者临床资料用于分析。

1.3.2血清总RNA的提取 按照MolPure®Blood RNA试剂盒说明书提取血清总RNA，简化步骤如下：血清样品用裂解液LB充分裂解后加入氯仿，混匀后12 000 r/min离心，取上层水相并加入无水乙醇(混合液)，将混合液置于RNA吸附柱并离心，经过去蛋白液及漂洗液洗涤后收集RNA。应用NnoDrop ONE测定RNA浓度及纯度。

1.3.3反转录 按照反转录试剂盒说明书将获取的合格RNA反转录为cDNA，反应条件为37 ℃ 60 min， 85 ℃ 5 min，用DEPC水2倍稀释cDNA后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.4实时荧光定量PCR 荧光定量PCR总反应体系为20 μL，包括2 μmol/L上、下游引物各2 μL，2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。循环参数：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 15 s(采集荧光信号)，共40个循环。lncRNA ELFN1-AS1：正向引物5′- CCT GAT GTT CTG CTT GGT TAT-3′，反向引物5′-ACA CAG CTC CTG CTC TTG-3′；18S(内参基因)：正向引物5′-ACA GGA TTG ACA GAT TGA-3′，反向引物5′-TAT CGG AAT TAA CCA GAC A-3′。使用QuantStudio Design Software v1.4.3进行熔解曲线分析，评测PCR产物的特异度。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA ELFN1-AS1的相对表达水平，公式为ΔΔCt=结直肠癌(Ct目的-Ct内参)-健康对照(Ct目的-Ct内参)。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计分析。数据为非正态分布，以M(P25,P75)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价lncRNA ELFN1-AS1对结直肠癌的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1结直肠癌组与对照组血清lncRNA ELFN1-AS1检测结果 结直肠癌组血清lncRNA ELFN1-AS1的相对表达水平[2.291(1.23,4.55)]明显高于对照组[0.46(0.13,1.27)](Z=-5.209,P<0.001)，见图1。

图1 血清lncRNA ELFN1-AS1在对照组与结直肠癌组中的相对表达水平

2.2血清lncRNA ELFN1-AS1相对表达水平与结直肠癌患者临床病理参数关系 将血清lncRNA ELFN1-AS1相对表达水平与结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移状态、TNM分期进行分析，结果发现血清lncRNA ELFN1-AS1相对表达水平在不同淋巴结转移、远处转移状态及TNM分期患者之间差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径患者之间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 血清lncRNA ELFN1-AS1相对表达水平与结直肠癌患者临床病理参数的关系[M(P25,P75)]

2.3血清lncRNA ELFN1-AS1检测对结直肠癌的诊断价值 绘制ROC曲线评估lncRNA ELFN1-AS1对结直肠癌的诊断效能，结果表明lncRNA ELFN1-AS1的ROC曲线下面积(AUC)为0.821(95%CI：0.734～0.908)，当最佳截断值为1.465时，其诊断结直肠癌的灵敏度为74.0%，特异度为82.5%，见图2。

图2 血清lncRNA ELFN1-AS1诊断结直肠癌的

3 讨 论

近年来，lncRNA被报道参与了结直肠癌的发生过程[8]。研究表明，lncRNA ELFN1-AS1不仅参与结直肠癌的发生，且在细胞迁移及肿瘤侵袭中发挥重要作用。LEI等[9]发现,lncRNA ELFN1-AS1在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平明显高于邻近癌旁正常组织，lncRNA ELFN1-AS1表达水平较高的患者生存率明显降低。DU等[10]发现，lncRNA ELFN1-AS1可以海绵样吸附miR-191-5p，从而释放特殊AT丰富序列结合蛋白1(SATB1)的促癌作用促进结直肠癌的生长及转移。笔者前期发现，lncRNA ELFN1-AS1通过激活Erk及EMT信号通路，促使结直肠癌细胞的增殖和迁移[7]。本研究结果提示，结直肠癌组血清中可稳定表达lncRNA ELFN1-AS1，且其相对表达水平明显高于对照组，血清中lncRNA ELFN1-AS1相对表达水平在不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径患者之间差异无统计学意义(P>0.05)，但在不同临床TNM分期、不同淋巴结转移和远处转移状态患者之间差异有统计学意义(P<0.05)，提示lncRNA ELFN1-AS1可能成为诊断结直肠癌的生物学标志。

癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析发现，结直肠组织(结直肠癌227例，正常对照26例)中lncRNA ELFN1-AS1的表达具有诊断结直肠癌的潜在价值,其诊断结直肠癌的灵敏度为87.6%，特异度为100.0%[11]。本研究结果显示，血清lncRNA ELFN1-AS1诊断结直肠癌的AUC为0.821，当最佳截断值取1.465时，灵敏度和特异度分别是74.0%、82.5%，进一步表明lncRNA ELFN1-AS1对诊断结直肠癌的重要价值。鉴于血清学的取材方便、无创性的特点，血清lncRNA ELFN1-AS1在结直肠癌筛查中可能更具明显优势。

lncRNA ELFN1-AS1表达水平在结直肠癌患者血清中明显升高，其表达水平与肿瘤转移和TNM分期有关，有望成为结直肠癌诊断的重要指标之一。但由于本研究样本量较小，仍需要进行大规模多中心临床研究来验证其有效性。