流式细胞术检测HLA-B27两种试剂比较与结果分析*

陈永强，郑 璐，张 玥，王杜平，程 星，陈艳红，周忠海，牛国平▲

1.徐州市中心医院检验科，江苏徐州 221009；2.徐州医科大学附属淮海医院实验科，江苏徐州 221004

强直性脊柱炎(AS)是一类以脊柱和骶髂关节慢性进行性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，发病机制主要与遗传、免疫反应和微生物感染等有关[1]。目前研究证实，人类白细胞抗原B27(HLA-B27)与AS发病具有很强的相关性，其阳性率在AS患者中高达90%，而在健康人群中阳性率仅为2%～7%[2]。有研究报道，HLA-B27介导TNAP磷酸酶活化促进AS中软骨组织的生成[3]。目前，HLA-B27已成为临床上辅助诊断AS的重要检测指标。在HLA-B27的检测方法中，流式细胞术因其具有检测速度快、灵敏度和特异度高等优点在临床上被广泛应用[4]。本研究主要比较美国贝克曼库尔特公司生产的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE检测试剂盒和美国BD公司生产的HLA-B27-FITC/CD3-PE检测试剂盒在临床HLA-B27检测过程中影响结果准确性的关键因素与异常结果分析，期望为临床提供可靠的检测报告。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集来自徐州市中心医院2019年8月至2020年7月门诊及住院的1 208例临床初诊为腰椎病、颈椎病、关节痛、脊柱僵硬和AS患者的外周血标本，采用肝素抗凝管抽取5 mL，所有标本均于当天应用流式细胞术完成HLA-B27的检测。

1.2仪器与试剂 CytoFLEX流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司生产，FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司生产。HLA-B27-FITC/CD3-PE试剂盒(货号：340183)和溶血素(货号：349202)为美国BD公司生产；HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒(货号：A07739)和溶血素(货号：A11895)为美国贝克曼库尔特公司生产。

1.3方法

1.3.1HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE检测试剂盒检测方法 向编号的检测管中依次加入10 μL检测抗体和50 μL肝素抗凝外周血，振荡混匀后置于室温避光处孵育20 min，然后每管加入0.5 mL货号为A11895溶血素，混匀避光孵育15 min，加入0.5 mL磷酸盐缓冲液，避光孵育平衡5 min，每管加2 mL磷酸盐缓冲液，1 600 r/min离心5 min，弃掉上清液，每管加0.5 mL磷酸盐缓冲液，振荡混匀后采用CytoFLEX流式细胞仪上机检测分析。

1.3.2HLA-B27-FITC/CD3-PE检测试剂盒检测方法 向编号的检测管中依次加入10 μL检测抗体和50 μL肝素抗凝外周血，振荡混匀后置于室温避光处孵育20 min，随后加入1 mL货号为349202的溶血素，涡旋振荡混匀后避光5 min，每管加入1 mL磷酸盐缓冲液混匀后1 600 r/min离心5 min，弃上清液，再用2 mL磷酸盐缓冲液洗涤1次后，加入0.5 mL磷酸盐缓冲液，振荡混匀后采用FACS Calibur流式细胞仪检测分析。

2 结 果

2.1两种试剂盒检测原理 美国贝克曼库尔特公司生产的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE检测试剂盒主要通过FSC和SSC双参数图圈定淋巴细胞亚群设门，然后分析淋巴细胞中 HLA-B7-HLA-B27+细胞群的百分比，比例≥90%判读为阳性，见图1；美国BD公司生产的HLA-B27-FITC/CD3-PE试剂盒首先通过FSC和SSC双参数图圈定淋巴细胞亚群设门，然后分析淋巴细胞群中CD3+淋巴细胞中HLA-B27的平均荧光强度，通过试剂盒自设平均荧光强度(MFI)临界值≥145判读为阳性(不同试剂批号MFI值略有差异)，见图2。

注：A为利用FSC和SSC双参数显示的免疫细胞散点图，B为对A图中圈定的淋巴细胞分析HLA-B7和HLA-B27表达水平散点图。

注：A为利用FSC和SSC双参数显示的免疫细胞散点图，B为对A图中圈定的淋巴细胞进一步分析CD3+淋巴细胞散点图，C为对B图中圈定的CD3+淋巴细胞分析HLA-B7的表达强度峰形图。

2.2淋巴细胞亚群分群不清晰对两种试剂盒检测结果的影响 结果发现，淋巴细胞亚群分群不清晰会导致HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE检测试剂盒将HLA-B7-HLA-B27+细胞群≥90%的阳性结果判读为阴性结果(<90%)，见图3；而HLA-B27-FITC/CD3-PE检测试剂盒利用FSC和SSC双参数图圈定淋巴细胞亚群，同时继续采用CD3-PE抗体进一步圈定表达CD3+淋巴细胞，可以避免淋巴细胞亚群分群不清晰导致的假阴性。

注：A、B为初次检测中淋巴细胞分群不清晰HLA-B27的检测结果，A为利用FSC和SSC双参数显示的免疫细胞散点图，其中淋巴细胞群分群质量较差，B为对A图中圈定的淋巴细胞分析HLA-B7和HLA-B27表达水平散点图；C、D为复检中淋巴细胞分群清晰HLA-B27的检测结果，C为利用FSC和SSC双参数显示的免疫细胞散点图，其中淋巴细胞分群质量较好，D为对C图中圈定的淋巴细胞分析HLA-B7和HLA-B27表达水平散点图。

2.3HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒检测HLA-B27异常结果统计与结果分析 采用HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒检测1 208份标本结果发现，除了标准的阴性标本和阳性标本之外，还存在两种异常的标本类型，异常标本1为淋巴细胞表达HLA-B7且细胞群主要分布于第一和第二象限之间；异常标本2为淋巴细胞表达HLA-B7且细胞群分布于第二象限或第二和第四象限之间，见图4。统计结果显示，阴性标本887份，占73.43%；阳性标本225份，占18.63%；而异常标本1共有84份，占6.95%；异常标本2共有12份，占0.99%。

注：从左往右依次为阴性标本、阳性标本、异常标本1、异常标本2。

随后，笔者对上述两种类型的异常标本采用美国BD公司生产的HLA-B27-FITC/CD3-PE检测试剂盒进行复测，结果显示，HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒检测的阴性和阳性标本与HLA-B27-FITC/CD3-PE试剂盒的检测结果一致；而异常标本1的MFI值介于阴性和阳性标本的数值之间，仍然判读为阴性标本；然而，12份异常标本2的MFI值均高于阳性临界值145，判读为阳性标本，见图5和表1。

注：从左往右依次为阴性标本、阳性标本、异常标本1、异常标本2。

表1 两种试剂盒检测HLA-B27结果比较

2.4HLA-B27检测结果与临床诊断之间的关系 对1 208份临床标本检测结果与临床诊断之间的关系分析结果显示，887份HLA-B27阴性标本中有32份临床诊断为AS患者，占3.16%；225份HLA-B7-HLA-B27+淋巴细胞比例≥90%的阳性标本中有52份临床诊断为AS患者，占23.11%；84份异常标本1中有1份临床诊断为AS患者，占1.19%；而12份异常标本2中有3份临床诊断为AS患者，占25.00%，见表2。异常标本1临床检测结果可判读为阴性，而异常标本2存在较高比例的AS患者。

表2 各组标本中临床诊断为AS患者所占比例

3 讨 论

流式细胞术因为具有快速、灵敏度高和特异度高等特点已成为临床常用检测HLA-B27表达的方法，但是该方法也存在一定的不足之处[5]。有文献报道，HLA-B27 的单克隆抗体会与其他 HLA-B 等位基因编码的抗原发生不同程度的交叉反应，其中以 HLA-B7抗原的交叉反应最常见[6-7]。因此，采用HLA-B27-FITC/CD3-PE两种抗体组合的试剂检测分析CD3+淋巴细胞表达HLA-B27时，对同时表达HLA-B7抗原的标本，HLA-B27单克隆抗体会与HLA-B7抗原发生交叉反应导致一定比例的标本检测结果呈假阳性；当采用HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE双抗体组合的试剂检测分析淋巴细胞群中HLA-B7-HLA-B27+细胞的比例时，可以排除因HLA-B27抗体与HLA-B7抗原交叉反应引起的假阳性。

在HLA-B27检测过程中，经常遇到一些可能由于溶血效果不好或细胞碎片等因素导致上机检测时淋巴细胞群分群不清晰的标本，本研究结果发现，HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒检测HLA-B27的方法会导致部分淋巴细胞群分群不清晰的阳性标本被误判为阴性标本，因此该检测方法对淋巴细胞群分群有较高的要求，对检测过程中遇到分群不清晰的标本一定要进行复检，而HLA-B27-FITC/CD3-PE试剂盒利用CD3-PE抗体进一步圈定表达CD3+淋巴细胞，可以避免淋巴细胞群分群不清晰导致的假阳性。HLA-B27-FITC/CD3-PE试剂盒检测方法容易将HLA-B7表达的标本误判为假阳性标本，而HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒可以将此类标本区分出来，但对于淋巴细胞同时表达HLA-B27抗原与HLA-B7抗原的标本检测结果仍无法准确判断，这类标本结果的判读只能结合病历资料或与临床医生沟通进行判断。为了能对本研究中异常标本2结果进行准确判断，后期笔者将收集该类标本并采用引物特异性聚合酶链反应(SSP-PCR)对HLA-B7和HLA-B27的表达情况进行检测[8]，然后结合临床诊断进一步分析，为今后提高临床AS患者的诊断率和结果的可靠性提供依据。

综上所述，两种HLA-B27试剂盒检测结果均准确可靠；HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE试剂盒能区分出HLA-B7/HLA-B27双阳性的疑似AS患者，但检测过程对淋巴细胞亚群分群要求较高；而HLA-B27-FITC/CD3-PE试剂盒利用CD3设门可以避免淋巴细胞亚群分群不清导致的假阴性结果的出现，但不能区分HLA-B7/HLA-B27双阳性标本且在结果判读中存在一定比例的假阳性。