间变性胶质细胞瘤中免疫浸润核心基因ZAP70与患者预后的相关性研究*

余 豪， 汪珉杰， 王 旋， 姜晓兵

华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科，武汉 430022

胶质瘤是成人最常见的颅内恶性肿瘤，世界卫生组织(WHO)根据肿瘤形态学特征将胶质瘤分为4个不同的病理级别[1]。间变性胶质细胞瘤(WHO Ⅲ级)，恶性程度仅次于胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)，约占总胶质瘤的20%，手术切除联合放化疗是目前主要的治疗方案。间变性胶质细胞瘤患者的中位生存时间约为37.6个月，其中IDH突变型伴1p/19q共缺失的患者预后相对较好，IDH野生型伴1p/19q未缺失的患者预后相对较差[2]。然而，即使是分型相同的间变性胶质细胞瘤患者，其预后差异仍较大，说明现有的标记物对患者预后的预测能力有限。因此，亟需探寻间变性胶质细胞瘤中新的预后相关基因，从而更精准地区分不同预后的患者，并以此为靶点实现进一步的个体化治疗。

肿瘤免疫微环境(TME)是指肿瘤细胞与肿瘤内部的免疫细胞(T细胞、B细胞、中性粒细胞及巨噬细胞等)相互作用形成的复杂网络[3]。近年来，肿瘤免疫微环境在胶质瘤发生发展中起到的重要作用被不断揭示[4]。例如，CD8+T细胞和M1样巨噬细胞发挥抗癌作用；而M2样巨噬细胞、调节性T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSCs)分泌大量免疫抑制因子，抑制细胞毒性T细胞的正常功能，从而促进肿瘤进展[5]。同时，研究者不断探索能够调控肿瘤免疫微环境的关键基因。比如发现SYT16与胶质瘤预后及免疫细胞浸润相关[6]；LGALS1调控胶质瘤免疫抑制性微环境的形成等[7]。然而，目前多数研究是以胶质瘤或胶质母细胞瘤为整体进行免疫调控基因的研究，但对间变性胶质细胞瘤中免疫相关预后基因的研究相对缺乏。本研究通过对TCGA数据库中间变性胶质细胞瘤的转录组数据进行分析，量化间变性胶质细胞瘤样本的免疫浸润情况。对低免疫浸润组、中免疫浸润组和高免疫浸润组患者间的生存曲线进行计算，并对两两组间的差异基因进行分析，最终找到免疫浸润相关的核心风险基因ZAP70。利用临床患者手术标本及患者预后随访信息验证ZAP70表达量与间变性胶质细胞瘤患者预后的关系，并通过GSEA富集分析了解ZAP70的相关通路，以期深入了解间变性胶质细胞瘤免疫相关基因ZAP70的功能，从而更好地指导临床工作[8]。

1 材料与方法

1.1 数据来源与胶质瘤样本收集

通过TCGA数据库下载间变性胶质细胞瘤(WHO Ⅲ级)患者的转录组数据以及临床信息，剔除生存数据缺失的样本，用于后续生物信息学分析。新鲜肿瘤样本来源于华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科，选取2010年1月至2017年12月入院进行手术的胶质瘤患者，术中留取患者肿瘤组织样本，将其置于4%多聚甲醛中保存，参照病理检测报告进行肿瘤分级，并进行石蜡包埋，分别制作数张空白切片备用，剩余以组织块形式保存，术后对患者进行生存信息随访(统一在2020年6月进行电话随访)。从肿瘤组织样品中选取WHO Ⅲ级的胶质瘤患者样本进行后续免疫组化分析。

1.2 生物信息学分析

ssGSEA(single sample GSEA)是主要针对单样本无法使用GSEA而提出的一种实现方法。根据表达谱文件计算每个基因的rank值，可以得到每个样本的免疫细胞或者免疫功能、免疫通路的活性，然后根据免疫活性进行分组。首先基于ssGSEA算法量化免疫浸润程度，再通过聚类分析将间变性胶质细胞瘤样本分为低、中、高免疫浸润组。通过K-M曲线对上述3组患者进行两两组间比较，并找出差异显著(P<0.05)且表达差异在2倍以上的基因。然后通过蛋白互作关系在线分析网站(https：//www.string-db.org/)找出核心基因，并采用单因素Cox回归分析计算出核心基因中有预后价值的基因[9]。挑选上述结果中最核心的风险基因ZAP70，对ZAP70表达量与间变性胶质细胞瘤临床信息的相关性进行探索，并利用GSEA分析ZAP70在间变性胶质细胞瘤中相关的信号通路[10]。

1.3 免疫组化与表达量分析

新鲜肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化及表达量分析。通过对切片的脱蜡，梯度乙醇脱水，洗涤，抗原修复，封闭(SAP-100，索莱宝，北京)，ZAP70抗体(A2195，ABclonal，中国)及二抗孵育，洗涤后进行光学显微镜下DAB显色(ZLI-9017，索莱宝，北京)。扫描免疫组化染色切片，通过Image J软件对免疫组化结果进行量化，将入组患者分为ZAP70高、低表达两组。

1.4 统计学方法

ssGSEA、差异基因分析、单因素Cox回归分析、K-M曲线生存分析等统计学分析均采用R 4.0.2软件进行。数据均通过Shapiro-Wilk test进行正态性检测，Wilcoxon-Mann-Whitney检验用于差异基因分析，t检验用于临床特征亚组之间的表达量比较。热图、火山图、韦恩图、散点图、森林图等均用R语言绘制，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 间变性胶质细胞瘤纳入样本信息及免疫浸润分组

通过对TCGA数据库的数据下载整理，以及对生存时间缺失数据的剔除，共纳入间变性胶质细胞瘤样本236例。其中男性135例，女性101例。组织学分型：间变性星形细胞瘤111例，间变性少突星行细胞瘤51例，间变性少突胶质细胞瘤74例。IDH突变型169例，野生型67例。1p/19q共缺失70例，未缺失166例。MGMT启动子甲基化190例，未甲基化46例。TERT启动子突变型71例，野生型71例，未知94例。ATRX突变型74例，野生型162例。转录组分型：经典型(classical，CL)32例、原神经细胞型(proneural，PN)94例、神经元型(neural，NE)35例、间质型(mesenchymal，ME)19例，未知56例。如图1热图显示，基于转录组数据采用ssGSEA方法量化肿瘤免疫浸润细胞，其中红色越深代表含量越高，蓝色越深代表含量越低。同时以无监督层次聚类算法将间变性胶质细胞瘤样本根据免疫细胞浸润情况分为低免疫浸润组(n=57)、中免疫浸润组(n=167)和高免疫浸润组(n=12)。

图1 236例间变性胶质细胞瘤样本免疫浸润分组Fig.1 Clustering of 236 anaplastic glioma samples based on immune infiltration level

2.2 间变性胶质细胞瘤低、中、高免疫浸润组预后及差异基因分析

利用K-M曲线比较低、中、高免疫浸润组间的总生存时间差异。如图2A所示，低免疫浸润组的预后最佳，中免疫浸润组次之，高免疫浸润组的预后最差，且差异有统计学意义(P=0.00011)。随即分析不同免疫浸润组间差异表达的基因，结果显示：与低免疫浸润组相比，中免疫浸润组中1421个基因上调，231个基因下调(图2B)；而与中免疫浸润组相比，高免疫浸润组中1905个基因上调，2149个基因下调(图2C)。通过对上述两组差异基因进行交集处理与韦恩图的绘制(图2D)，得到在间变性胶质细胞瘤样本中与免疫浸润显著相关的762个基因，其中包括709个上调基因与53个下调基因。

A：低、中、高免疫浸润组K-M生存曲线；B：低、中免疫浸润组差异基因火山图；C：中、高免疫浸润组差异基因火山图；D：低、中、高免疫浸润组差异基因韦恩图图2 间变性胶质细胞瘤3个免疫浸润组预后及差异基因分析Fig.2 Prognosis and differential gene analysis of three immune infiltration groups with anaplastic glioma

2.3 核心风险基因筛选

将上述762个差异基因进行蛋白互作网络分析，筛选出互作打分大于0.95的节点。通过统计各个基因邻近节点数判定核心基因。图3A显示前30个核心差异基因，其中包括基质分子(FN1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2)，趋化因子及受体(CCL5、CCL20、CXCL9、CXCL10、CCR2、CCR5)，细胞因子(IL-10、IL-6)及白细胞相关抗原(HLA-DRA、HLA-DMA、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DMB、HLA-DPA1、HLA-DQB1)等。单因素Cox回归分析进一步对以上核心基因的预后风险进行评估，可得其中16个基因为影响间变性胶质细胞瘤预后的风险基因，并且其中ZAP70的风险比值最高(图3B)。

A：核心基因柱状图；B：核心基因单因素Cox回归分析结果森林图图3 核心风险基因筛选Fig.3 Screening of core risk genes

2.4 ZAP70表达量与间变性胶质细胞瘤患者预后及临床特征相关性分析

图4中K-M生存曲线结果显示，ZAP70高表达的间变性胶质细胞瘤患者生存时间显著少于ZAP70低表达患者(P<0.05)。对ZAP70表达量与多个临床特性间的关系进行研究，结果如图5所示：在236例间变性胶质细胞瘤样本中，ZAP70的表达量在不同性别以及不同组织学分型中无显著差异(P>0.05)。大于60岁的老年患者中ZAP70的表达量显著高于不足60岁的患者(P<0.05)；IDH野生型患者中ZAP70的表达量显著高于IDH突变型患者(P<0.05)；1p/19q未缺失患者中ZAP70的表达量显著高于1p/19q共缺失患者(P<0.05)；MGMT启动子未甲基化患者中ZAP70的表达量显著高于MGMT启动子甲基化患者(P<0.05)；ATRX野生型患者中ZAP70的表达量显著高于ATRX突变型患者(P<0.05)；TERT启动子突变患者中ZAP70的表达量显著高于TERT启动子野生型患者(P<0.05)；根据转录组数据分型，经典型与间质型患者中ZAP70的表达量显著高于神经元型与前神经元型患者(P<0.05)。

图4 间变性胶质细胞瘤患者ZAP70表达量K-M生存曲线分析Fig.4 K-M curve analysis of ZAP70 expression in patients with anaplastic glioma

图中数值为P值图5 ZAP70表达量与间变性胶质细胞瘤临床特性的关系Fig.5 Relationship between ZAP70 expression and clinical features of anaplastic glioma

2.5 临床样本验证ZAP70表达量与间变性胶质细胞瘤预后关系

收集本院间变性胶质细胞瘤的样本并对患者进行随访，共纳入61例间变性胶质细胞瘤样本，根据免疫组化染色结果将ZAP70的表达量由低到高分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级(图6A)。Ⅰ、Ⅱ级定义为低表达组(31例)，Ⅲ、Ⅳ级定义为高表达组(30例)。通过K-M生存曲线比较高、低表达组的预后差异，结果显示：低表达组具有相对更好的预后趋势，但是差异不具有统计学意义(P=0.115)，可能是样本数过低导致，需要在后期纳入更多数量的样本(图6B)。

图6 间变性胶质细胞瘤样本ZAP70免疫组化染色(A)及K-M生存曲线分析(B)Fig.6 IHC(A) and K-M survival curve(B) analysis of ZAP70 with anaplastic glioma samples

2.6 GSEA分析间变性胶质细胞瘤中ZAP70富集的相关通路

如图7所示，间变性胶质细胞瘤中ZAP70的表达量与10条有生物学意义的通路显著相关。GSEA富集分析结果显示高表达ZAP70与耐药(ABC_TRANSPORTERS)、细胞粘附信号(FOCAL_ADHESION)、细胞外基质反应(ECM_RECEPTOR_INTERACTION)相关。同时，高表达ZAP70能够激活JAK-STAT以及NOTCH信号通路。在肿瘤免疫方面，高表达ZAP70与白细胞迁移(LEUKOCYTE_TRANSENDOTHELIAL_MIGRATION)及固有免疫缺失(PRIMARY_IMMUNODEFICIENCY)相关。

图7 间变性胶质细胞瘤ZAP70多GSEA富集分析Fig.7 Multi-GSEA analysis of ZAP70 in anaplastic glioma

3 讨论

间变性胶质细胞瘤是临床上较为常见的颅内恶性肿瘤，虽然多数情况下恶性程度不如胶质母细胞瘤，但是间变性胶质细胞瘤患者的预后差异较大，现有的分子标记物对间变性胶质细胞瘤患者预后的预测能力有限。因此亟需新的标记物用以将间变性胶质细胞瘤患者作进一步分类，进而采取更加个体化的治疗方案[11]。肿瘤免疫是近年来肿瘤诊断治疗方面研究的热点，免疫微环境对肿瘤的发生发展起到关键作用，反之肿瘤细胞的基因改变也不断重塑着肿瘤免疫微环境[12]。通常情况下，胶质瘤细胞可以释放多种细胞因子促进各种免疫细胞的浸润，如MDSCs、小胶质细胞、Treg、巨噬细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞进入肿瘤微环境，并将上述细胞转化为可以帮助肿瘤细胞逃避免疫系统监视的表型[13]。

因此，本研究从免疫细胞浸润的角度出发，通过免疫浸润算法将公共数据库中间变性胶质细胞瘤样本按照免疫浸润等级进行分类。在分类结果的低、中、高免疫组中，免疫细胞浸润的程度越高，患者的预后越差。为了探索间变性胶质细胞瘤中促进肿瘤免疫微环境形成的关键因素，我们通过进一步的差异基因分析、核心基因分析以及Cox回归风险基因筛选，发现ZAP70是促进免疫细胞浸润且预后相关风险比最高的基因。在对ZAP70表达量与患者临床信息的相关性研究中，ZAP70在多种恶性临床特性的患者中高表达，比如老年患者、IDH野生型患者、1p/19q未缺失患者、MGMT未甲基化患者以及TERT启动子突变患者[14-16]。GSEA分析揭示了ZAP70的相关恶性通路，临床间变性胶质细胞瘤样本的免疫组化及预后分析也再一次验证了生物信息学分析的结果。

ZAP70编码蛋白属于蛋白酪氨酸激酶家族，在T细胞发育和淋巴细胞活化中发挥作用。该酶在T细胞抗原受体刺激后在酪氨酸残基上磷酸化，与Src家族激酶、Lck和Fyn一起在TCR介导的信号转导的初始阶段发挥作用。同时ZAP70也在肿瘤细胞中表达，前列腺癌与淋巴细胞性白血病中ZAP70能够促进肿瘤细胞侵袭与迁移[17-18]。目前对ZAP70的研究在血液肿瘤中较多，在实体瘤尤其是胶质瘤中尚未有研究。本文初步对ZAP70在间变性胶质细胞瘤中的表达情况进行探讨并对其临床意义进行分析，提示了ZAP70在间变性胶质细胞瘤患者预后预测中的重要价值，其有望成为间变性胶质细胞瘤患者中预后不佳亚群的有效治疗靶点。