BFAR 在胶质瘤中的表达及其与胶质瘤预后的关系

程 哲，汪潮潮，吴 娟，王 棒，周星辰

（蚌埠医学院第二附属医院神经外科，安徽 蚌埠 233000）

胶质瘤（glioma）为最常见的原发性中枢性神经系统的恶性肿瘤，具有高致死致残率[1-3]，其中胶质母细胞瘤（GBM）的发病率最高，占原发中枢系统恶性肿瘤的46.1%。尽管目前胶质瘤的诊疗技术不断更新，包括最大范围内的肿瘤切除术联合放化疗、基因靶向治疗、免疫治疗及电场疗法等，但胶质瘤患者平均生存期仅为12 个月，且5 年生存率不足5%[4-7]，因此，研究胶质瘤的发病机制尤为重要。双功能凋亡调节器（bifunctional apoptosis regulator，BFAR），其可以调控凋亡信号通路，一方面其能促进Bcl-2 和Bcl-XL 的相互作用，同时其也可以直接或间接与Caspase-8 和Caspase-10 的前体作用，从而阻碍Fas介导的凋亡信号通路[8]。研究表明[9]，BFAR 在组织中的表达具有高度特异性，在脑组织中为高表达。但目前关于BFAR 与起源于脑组织的胶质瘤研究较少，基于此，本研究通过肿瘤相关数据库来分析BFAR在胶质瘤中组织标本中的表达情况以及其与胶质瘤患者临床预后之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 数据库分析 使用癌症基因组图谱（cancer genome atlas，TCGA）在线数据库（GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/） 分 析BFAR 在 低 级 别 胶 质 瘤（LGG）及胶质瘤母细胞瘤（GBM）中的表达，应用中国脑胶质瘤基因图谱（Chinese glioma genome atlas，CGGA，http：/www.cgga.org.cn）数据库分析BFAR 在各个级别胶质瘤中的表达情况。

1.2 材料 人脑胶质瘤细胞U251、T98 和LN229 由苏州大学附属第二医院脑神经实验室惠赠；正常人脑星形细胞株NHA 购于合肥希研生物公司；细胞培养液DMEM 及胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司；Trizol试剂购于上海Sangon Biotech 公司；RIPA、PMSF 试剂及BCA 试剂盒购于上海碧云天公司；BFAR 及GAPDH 引物由上海Sangon Biotech 合成；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 及TransStart Tip Green qPCR Super Mix 购 于TRANS 公司；BFAR、GAPDH 一抗购于中国ABclonal公司；二抗（羊抗兔）购于BIOMIKY 公司。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR） 提取细胞总RNA，测定RNA 浓度。根据试剂盒中步骤：在每个反应中加入2.0 μg RNA，70 ℃温浴3 min，取出后冷却至室温，加0.5 μl 逆转录酶后置于37 ℃水浴60 min。20 μl 反应体系中含2 μl cDNA，在Roche Light Cycler96 仪器上进行45 个循环反应，按照94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s。设3 个重复组，结果以2-ΔΔCT值计算。BFAR 及GAPDH 的引物如下：BFAR 正向，5'-GAGTTTGCTTGGGACTGGTTGGAG-3'，反 向，5'-GAGGCACGGTCTTCAGTTCACTTC -3'；GAPDH 正向，5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，反向，5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，以GAPDH 的mRNA表达水平作为内参。

1.4 Western Blot 提取细胞总蛋白，BCA 法测蛋白质浓度，配置8%的分离胶，5%的浓缩胶；每孔上样10 μl，分别以浓缩胶80 V，30 min，分离胶120 V，1 h电泳；200 mA 湿转2 h；1% BSA 室温下封闭1 h；一抗：BFAR（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）4 ℃孵育过夜，二抗：1∶10000 室温下孵育1 h；ECL 曝光显影。

1.5 统计学方法 数据统计采用GrapPad Prism 8 及SPSS 17.0 软件处理，计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，生存分析采用Log-Rank 检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BFAR 在胶质瘤中的表达情况 基于TCGA 数据库分析显示，低级别胶质瘤BFAR 的表达高于非瘤脑组织（P＜0.05）；胶质母细胞瘤BFAR 表达高于非瘤脑组织（P＜0.05），且随着胶质瘤恶性程度增加，BFAR 的表达量增加，见图1。

2.2 BFAR 在胶质瘤中的预后情况 BFAR 低表达的胶质瘤患者总体生存时间长于BFAR 高表达的胶质瘤患者（P＜0.05）；高表达BFAR 的高级别胶质瘤患者总体生存期短于低表达BFAR 的高级别胶质瘤患者（P＜0.05）；异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型胶质瘤患者BFAR 表达高于IDH 突变型患者（P＜0.05）；非1p/19q 联合缺失的胶质瘤患者BFAR 表达高于1p/19q 联合缺失的患者（P＜0.05），见图2。

2.3 BFAR 在胶质瘤中与凋亡相关基因表达的相关性 基于TCGA 数据库分析显示，胶质瘤中BFAR与抗凋亡相关蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1 表达及促凋亡相关蛋白Bax、Bad、Bim 表达密切相关（P＜0.05），见图3。

2.4 BFAR 在胶质瘤细胞中表达情况 BFAR 蛋白在胶质瘤细胞U251、T98 和LN229 中的表达比正常星形胶质细胞NHA 中高（P＜0.05）；定量PCR 显示，BFAR mRNA 在胶质瘤细胞U251、T98 和LN229 中的表达比正常星形胶质细胞NHA 中高（P＜0.05），见图4。

图1 BFAR 在胶质瘤中的表达情况

图3 胶质瘤中BFAR 的表达与凋亡相关基因的关系

图4 胶质瘤细胞中BFAR 表达情况

3 讨论

胶质瘤具有高度的侵袭性和致死性，虽然临床上治疗方式不断更新，但患者的总体预后仍较差[10]。因此，在胶质瘤的发病机制及相关药物治疗中需积极探索寻找新的基因或者通路来调控胶质瘤的生长及侵袭[11]。BFAR 为凋亡调控相关基因，然而有关其在胶质瘤中的研究甚少。

本研究基于TCGA 数据库分析显示，低级别胶质瘤BFAR 的表达高于非瘤脑组织（P＜0.05）；胶质母细胞瘤BFAR 表达高于非瘤脑组织（P＜0.05），且随着胶质瘤恶性程度增加，BFAR 的表达量增加；且BFAR 低表达的胶质瘤患者总体生存时间长于BFAR 高表达的胶质瘤患者（P＜0.05）；高表达BFAR的高级别胶质瘤患者总体生存期短于低表达BFAR的高级别胶质瘤患者（P＜0.05），提示胶质瘤中BFAR 的表达情况可以作为其预后判断的指标之一。异柠檬酸脱氢酶家族包括IDH1、IDH2 和IDH3这3 种异构酶，胶质瘤多伴有IDH1、2 的突变，而伴有IDH 突变的胶质瘤患者往往预后较好[12]。少突胶质细胞瘤中染色体1p/19q 联合性缺失最为常见，1p/19q 联合缺失的胶质瘤患者总生存期和无进展生存期较长[13-15]。大量研究表明胶质瘤一旦合并IDH突变及1p/19q 联合缺失其对放化疗更敏感。本研究中异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型胶质瘤患者BFAR表达高于IDH 突变型患者（P＜0.05）；非1p/19q 联合缺失的胶质瘤患者BFAR 表达高于1p/19q 联合缺失的患者（P＜0.05），提示胶质瘤中IDH 突变及1p/19q 联合缺失可使胶质瘤患者对放化疗更敏感，因此BFAR 影响胶质瘤预后很有可能与胶质瘤的放化疗相关。

BFAR 被认为可以调控凋亡信号通路，一方面可以作用于抗凋亡相关基因，另一方面可以调控于促凋亡相关基因，其对凋亡信号的调控处于动态平衡状态。本研究基于TCGA 数据库分析显示，胶质瘤中BFAR 与抗凋亡相关蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1表达及促凋亡相关蛋白Bax、Bad、Bim 表达密切相关（P＜0.05），但关于胶质瘤中BFAR 调控凋亡相关通路及基因的机制还需要大量基础研究进一步探索。此外，本研究结果显示，BFAR 蛋白在胶质瘤细胞U251、T98 和LN229 中的表达比正常星形胶质细胞NHA 中高（P＜0.05）；定量PCR 显示，BFAR mRNA 在胶质瘤细胞U251、T98 和LN229 中的表达比正常星形胶质细胞NHA 中高（P＜0.05），提示BFAR在胶质瘤细胞中表达上调。

综上所述，BFAR 在胶质瘤中表达上调且与胶质瘤患者的预后密切相关，其中与促凋亡及抗凋亡相关基因表达关系密切。然而BFAR 在胶质瘤中是如何调控凋亡通路及其与胶质瘤的耐放化疗之间的关系都需要进一步的研究，其很有可能成为胶质瘤治疗的靶点基因。