POU3F2在胶质瘤中的表达及其临床意义

周洛文 王俊文 舒凯 徐钰

胶质瘤在所有成人颅内恶性肿瘤中的占比接近60%，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤[1]。目前，对胶质瘤的治疗主要为以手术切除为主，辅之以放、化疗等综合治疗手段。因为胶质瘤的恶性生物学特性，在改善胶质瘤病人的预后方面仍未取得重大突破性进展[2]。POU3F2编码八聚体结合转录因子7(OCT-7)，OCT-7是一种中枢神经系统表达特异性转录因子，其异常表达与肿瘤干细胞的干细胞样表型维持有密切关系[2-4]。恶性肿瘤的复发以及其抵抗放化疗的能力可能与肿瘤干细胞存在密切关系。有研究指出，有包括 POU3F2 在内的 19种神经发育相关性的转录因子参与了维持胶质瘤干细胞的干细胞样表型并阻止其分化[5-8]。我们以CGGA数据库作为基础，分析POU3F2在胶质瘤中的表达并进行验证，探讨其临床意义。

对象与方法

一、对象

通过CGGA数据库(http://www.cgga.org.cn/)下载最新的325例胶质瘤mRNAseq的转录组数据及临床信息。其中，WHO Ⅱ级胶质瘤病人109例，Ⅲ级与Ⅳ级分别为72例与144例。临床样本来自2018～2020年我院神经外科住院手术的40例胶质瘤病人，其中低级别胶质瘤组(WHO Ⅰ～Ⅱ级)与高级别胶质瘤组(WHO Ⅲ～Ⅳ级)各20例。

二、方法

1.免疫组化染色检测POU3F2表达:采用免疫组化染色检测POU3F2蛋白表达，手术切除的脑胶质瘤组织样本10%甲醛溶液固定，然后脱水，石蜡包埋，切片，切片厚度为600 μm，POU3F2抗体稀释工作浓度1∶200。结果判读采用半定量法，每张切片随机取5个高倍镜视野，根据细胞核处染色强度取0,1,2的三分制进行评分并取均值，由两名病理医生单独评分。

2.生信数据分析:使用R语言ggpubr包分析POU3F2表达量与胶质瘤WHO分级、胶质瘤分子标志物以及胶质瘤分子亚型的对比组合并绘制箱线图，使用R语言pROC包对POU3F2预测胶质瘤分子亚型进行分析并绘制ROC曲线，使用R语言survival包对POU3F2高表达组与低表达组病人进行Kaplan-Meier生存分析。

三、统计学方法

POU3F2蛋白表达积分差异采用t检验，POU3F2基因表达水平的比较采用Kruskal-Wallis单因素方差分析，采用ROC曲线分析POU3F2基因表达经典型的预测价值，采用Kaplan-Meier生存曲线比较分析POU3F2表达量与胶质瘤预后之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义，由R语言编程直接绘图并完成统计学分析。

结果

1.POU3F2在高级别胶质瘤中表达上调，在1p19q联合缺失胶质瘤中表达下调:提取CGGA数据库中POU3F2的基因表达水平的数据，基于数据集提供的临床信息分为WHO Ⅱ级与WHO Ⅲ级和Ⅳ级，绘制各组中POU3F2表达水平的箱线图(图1A)。可见在低级别胶质瘤组(WHO Ⅱ级)中，POU3F2的表达量较之高级别胶质瘤组(WHO Ⅲ～Ⅳ级)相对更低，差异有统计学意义(P<0.01)。POU3F2在不存在染色体1p19q联合缺失的分组中的表达倾向上调，且与染色体1p19q联合缺失分组差异显著，差异有统计学意义(图1B，P=0.003 1)。

A.POU3F2在低级别胶质瘤组(WHO Ⅱ级)与高级别胶质瘤组(WHO Ⅲ～Ⅳ级)中的表达分布；B.POU3F2在胶质瘤1p19q共缺失组及非共缺失组中的表达分布

对POU3F2蛋白在胶质瘤中的表达进行免疫组化染色检测，可见低级别组(图2A)POU3F2蛋白的表达水平低于高级别胶质瘤组(图2B)，半定量分析结果(图2C)亦提示高级别胶质瘤组切片中POU3F2表达水平半定量得分高于低级别组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A.低级别胶质瘤组；B.高级别胶质瘤组；C.POU3F2免疫组化半定量分析

2.POU3F2在经典型胶质瘤高表达，与胶质瘤预后相关：基于癌症基因组图谱(TCGA)所定义的四种分子亚型：经典型(classical)，间质型(mesenchymal)，神经元型(neural)以及前神经元型(proneural)，对数据样本进行重分组并绘制箱线图(图3A)，可见在本组数据集中，POU3F2在经典型胶质瘤中的表达水平最高，且对比其他三种分子亚型差异明显(P<0.000 1)。绘制POU3F2基因表达预测经典型的ROC曲线(图3B)，以评估POU3F2在此亚型中的预测能力。可见ROC曲线下的面积(Area Under Curve,AUC)为0.784，这提示POU3F2有作为潜在的预测胶质瘤经典型分子标志物的价值。

A.POU3F2在胶质瘤TCGA 4种分子亚型中的表达;B.预测经典型的ROC曲线;C.不同POU3F2表达水平的胶质瘤病人的Kaplan-Meier生存曲线

应用Kaplan-Meier生存分析评估本数据集中POU3F2表达量与胶质瘤预后之间的关系，由Kaplan-Meier生存曲线(图3C)可以看出，高表达POU3F2的胶质瘤病人总生存期更短(Log rankP=0.016)。

讨论

胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤，根据WHO的分级可分为Ⅰ～Ⅳ四个等级，其恶性程度随等级升高而升高。其中，WHO Ⅰ～Ⅱ级通常被归于低级别胶质瘤组，WHO Ⅲ～Ⅳ级通常被归于高级别胶质瘤组。高级别胶质瘤的生物学特性常常发生改变，表现出较高的浸润、转移、增殖以及血管生成等能力，其预后也较差。这种恶性生物学特性可能与肿瘤干细胞存在密切关系，肿瘤干细胞是诱导胶质瘤发生与发展，造成肿瘤复发及抵抗治疗的重要原因之一。有研究发现，POU3F2有诱导已分化的胶质瘤细胞重编程为胶质瘤干细胞的能力。

本研究中，我们发现在高级别胶质瘤组的POU3F2的表达量倾向上调。免疫组化染色亦提示高级别胶质瘤组POU3F2蛋白染色阳性细胞数显著高于低级别组。1p/19q共缺失被认为是对化疗更敏感，预后更好的标志之一[9-13]。我们的研究还发现，POU3F2在1p/19q共缺失组中的表达下调，提示POU3F2的表达水平与胶质瘤的恶性程度存在关系。胶质瘤可以分为四种分子亚型，分别为经典型(classical)，间质型(mesenchymal)，神经元型(neural)以及前神经元型(proneural)[12-13]。一项941例恶性胶质瘤的研究指出，神经元型和前神经元型主要出现在低级别胶质瘤样本中，而经典型和间质型更多出现在高级别胶质瘤样本中，且生存分析发现，经典型胶质瘤的临床预后最差[14]。本研究发现，POU3F2可用于预测分子亚型为经典型的胶质瘤，与我们对POU3F2参与恶性胶质瘤生物学机制的猜想相符。

对POU3F2的上下游调控关键基因进行生物信息学分析发现，SOX2和SOX21基因与POU3F2共表达，这些基因在维持胶质瘤干细胞的去分化状态中发挥作用[15-20]。SOX2是重要的细胞重编程基因，在胶质瘤干细胞中存在异常高表达，是胶质瘤干细胞的表面分子标志物之一。SOX21则被认为可与SOX2形成复合物共同发挥作用[20]。我们推测，POU3F2基因可能通过与上述基因一起通过对胶质瘤干细胞的作用参与胶质瘤的发病。

本研究表明，胶质瘤组织中POU3F2表达量的增加与其恶性表型存在联系。POU3F2表达量的增加提示病人预后不佳，POU3F2可望作为胶质瘤诊断和预后指标的分子标志物。POU3F2可能与神经胶质瘤干细胞增殖和维持非分化状态有关，通过与POU3F4、SOX2、SOX9、SOX21等基因共同作用促进胶质瘤的发生。