秋水仙碱诱导粗皮桉花粉染色体加倍研究

刘 钊 熊 涛 赵英伟 杨 珺,* 康向阳

(1 北京林业大学林木育种国家工程实验室，北京 100083；2 北京林业大学林木、花卉遗传育种教育部重点实验室，北京 100083；3 北京林业大学城乡生态环境北京实验室，北京 100083；4 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；5 广西壮族自治区国有东门林场，广西 扶绥 532199)

桉树(Eucalyptusspp.)隶属桃金娘科桉属高大乔木，具有生长迅速、适应性强等特点[1]，是世界上最重要的人工商品林树种之一，为工业生产提供了大量木材[2-3]，为制浆造纸提供了充足原料[4]。桉树叶片含有的桉油还具有多种生物活性，是杀虫剂、除草剂及各种药品和化妆品中的重要有效成分[5-6]。作为世界上最重要的森林产品供应源，桉树在超过200个国家和地区广泛引种种植[7-8]。目前，全球范围内桉树人工商品林主要栽培使用的是杂交种[9]，但是近年来桉树的遗传改良遇到瓶颈，以杂交育种为主的良种选育已难以满足日益增长的工业生产需求[10]。

多倍体育种是一种高效的林木遗传改良途径，已成功应用于许多重要阔叶树种的良种选育工作[11-14]。有研究表明，三倍体林木在生长速度、木材材性[15-16]、次生代谢产物含量[17]、病虫害抗性[18]等特性上相较二倍体具有显著优势。可以预见，开展桉树多倍体新品种选育，对于提升桉树木材产量和品质具有重大意义。目前，自然界中仍未发现天然多倍体桉树的存在[19]，虽人工诱导体细胞染色体加倍获得了四倍体桉树[20-21]，但其在株高地径生长上较二倍体并无优势[22]。因此人工诱导桉树配子染色体加倍，经授粉杂交获得三倍体新种质是桉树多倍体种质创新工作的重要途径。

秋水仙碱是一种可以有效阻断染色体分离的诱变剂，已成功应用于许多物种的染色体加倍研究工作[23-26]。但桉树经秋水仙碱诱导花粉染色体加倍的相关研究极少，仅在尾叶桉上成功诱导获得了少量未减数2n花粉，且诱导的有效率较低[27]。康向阳等[28]在杨树花粉染色体加倍研究中证明，提高人工诱导花粉染色体加倍效率的关键在于准确预判和选择对秋水仙碱敏感的小孢子母细胞减数分裂的特定时期，以及恰当的诱导处理强度。此结果为进一步开展人工诱导桉树花粉染色体加倍研究提供了重要理论依据。

本研究以粗皮桉(EucalyptuspellitaF.V.Muell.)为对象，通过对花蕾发育以及小孢子母细胞减数分裂细胞学的特征与进程等进行观察和分析，总结花蕾发育与小孢子母细胞减数分裂的时序性规律；通过对不同发育阶段花蕾施加秋水仙碱处理诱导粗皮桉花粉染色体加倍，研究建立高效诱导桉树未减数2n花粉技术体系，以期为进一步开展桉树三倍体种质创新工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以广西壮族自治区国有东门林场杂交育种园内2015年定植的粗皮桉无性系为研究材料。该无性系共有20棵分株，经连续3年观察，分株间长势一致、花期稳定且花量较大，适宜开展花粉染色体加倍技术研究。

1.2 材料采集

在无性系中选定长势和花枝发育较为一致的10棵分株作为研究材料，于2019年分别选取朝向一致向南、距地面高度相近、花蕾数量相对一致的若干花枝作为候选采样花枝。根据候选花枝自主枝基部起向顶端的着生位置，采用阿拉伯数字顺序对候选花枝进行编号；对每个花枝上不同着生位置的花序，自花枝基部起向顶端使用英文大写字母顺序依次编号(图1)。如编号2-D表示自主枝基部向顶端的第2花枝上，自花枝基部起的第4个花序。

图1 花蕾采样编号Fig.1 Sampling number of flower bud

自进入花期起，持续监测候选花枝上花蕾发育与小孢子母细胞减数分裂情况。当首次观察到目标花枝上有小孢子母细胞进入减数分裂细线期时，进行首次采样并记为时间点0 h，此后每隔24 h进行花蕾采样，直至采样结束。使用游标卡尺测量待采花蕾直径(测量3次取平均值)，然后立即将花蕾摘下放入预冷的卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中进行固定，并做好标记和数据记录。所有采样花蕾在4℃下固定24 h后更换至装满70%乙醇的离心管中完全浸泡，置于4℃冷藏贮存待用。

1.3 小孢子母细胞减数分裂的细胞学观察

采用醋酸洋红压片法观察粗皮桉小孢子母细胞减数分裂进程：固定好的花蕾沿蒴盖脱落环位置进行环割，取下蒴盖后挑取花丝顶端的花药转移至载玻片，滴加2%醋酸洋红染液，镊子夹碎花药游离出小孢子母细胞，染色5 min后盖好盖玻片。使用BX51光学显微镜(日本Olympus公司)观察记录粗皮桉小孢子母细胞减数分裂各分裂相的特征及占比，并进行显微拍照。

1.4 人工诱导粗皮桉花粉染色体加倍

于2020年开展秋水仙碱溶液处理花蕾诱导粗皮桉花粉染色体加倍工作，采用将秋水仙碱溶液导入花枝切口的方法对候选花枝上的目标花蕾进行处理[29]，诱导粗皮桉未减数2n花粉：在近花序位置，用刀具斜向切入花枝，造成深至木质部的切口。于切口处塞入棉线并用封口膜固定，棉线另一端置于离心管内，将离心管内0.5%浓度的秋水仙碱溶液导入切口花枝，经植物维管系统输送至花药内实现对小孢子母细胞的诱变处理，处理持续时长分别设置为3和6 h；诱变处理的同时设置不做处理的对照组，并做好标记。为统计未减数2n花粉的有效诱导率，散粉时采集若干处理组和对照组单花，经卡诺固定后对花粉进行醋酸洋红制片观察，以单花内未减数2n花粉占比超过1%为有效处理的标准，统计有效诱导率[30]。此外，为研究不同处理组别中小孢子母细胞处于减数分裂的具体时期，在进行秋水仙碱诱导处理的同时采集固定临近花枝处于相同发育状态的花蕾，留待细胞学观察和统计分析。

1.5 数据分析

使用SPSS软件处理试验数据：采用一般线性模型分析不同着生位置花蕾的平均直径差异[31]；差异显著时采用最小显著差数法(least significant difference,LSD)进行多重比较；有效诱导率与小孢子母细胞减数分裂各时期占比数据经平方根反正弦转换后，计算皮尔森相关系数；使用Excel软件制图。

2 结果与分析

2.1 粗皮桉长、短花丝雄蕊小孢子母细胞减数分裂观察

根据采样时间将花蕾样本分为采样组Ⅰ(48～96 h)、采样组Ⅱ(144～196 h)和采样组Ⅲ(240 h)共3组，对各组内单花依次进行醋酸洋红压片制片和显微观察，发现单一花蕾制片中存在多个不连续的小孢子母细胞减数分裂相。进一步观察统计发现(表1)，粗皮桉单花内生有两种类型雄蕊：长花丝雄蕊(长花丝向内卷曲、蒴盖脱落前花药紧贴花柱)和短花丝雄蕊(卷曲于长花丝内侧)；各组别内单花内长雄蕊上小孢子母细胞减数分裂进程总是领先于短雄蕊。如当单花内长雄蕊上小孢子母细胞主要处于减数分裂细线期和粗线期时，短雄蕊上小孢子母细胞多数处于未进入减数分裂期的状态(采样组Ⅰ)；当长雄蕊上大部分小孢子母细胞发育至四分体和小孢子时期时，短雄蕊上小孢子母细胞仍以处于减数分裂中期Ⅰ-末期Ⅱ状态为主(采样组Ⅱ)。为便于统计各采样时间点不同着生位置花蕾小孢子母细胞减数分裂的具体发育进程，后续研究统一以单花内长雄蕊上小孢子母细胞减数分裂所处的主要时期，认定为该花蕾的小孢子母细胞减数分裂时期，进行相关统计分析。

表1 粗皮桉花蕾内不同类型雄蕊小孢子母细胞减数分裂时期Table 1 Meiosis stage of microsporocytes among stamens of different types in the bud of Eucalyptus pellita

2.2 粗皮桉小孢子母细胞减数分裂细胞学特征与进程

根据采样时间点和花蕾着生位置，依次对粗皮桉小孢子母细胞减数分裂进程进行连续观察和统计。结果表明(附表S1)，粗皮桉小孢子母细胞自进入减数分裂细线期至发育为小孢子共历时240 h。在0 h采样样本中，可以首次观察到有少量花蕾小孢子母细胞开始进入减数分裂细线期(图2-a)；随后在24～72 h采样样本中，可以观察到花蕾小孢子母细胞减数分裂终变期及以前各个分裂相，其中以前期Ⅰ为主，此阶段染色体逐渐收缩变粗并最终聚缩成点状或条状(图2-b，c,d)；在96 h采样样本中开始观察到中期Ⅰ至末期Ⅰ等分裂相，此阶段特点是胞内染色体开始从赤道板移向两极并逐渐解螺旋(图2-e,f,g)；此后，在144 h采样样本中小孢子母细胞处于第二次减数分裂期的占比逐渐增多，此时可观察到平行或T形排列在赤道板附近的两组染色体逐渐移至四极，核膜、核仁重新出现(图2-h)；采样至168 h时，小孢子母细胞发育至四分体和小孢子的花蕾已占多数，此时可清楚观察到含4个子细胞的四分体细胞，以及游离出的正四面体形小孢子，在显微镜下投影平面为三角形(图2-k,l)；至240 h采样点，花蕾内仅能观察到小孢子。

同一时间点采集的若干花蕾样本所处的减数分裂时期存在差异，具体表现为同一花枝上不同着生位置花蕾的减数分裂进程不同步，处于形态学上端位置的花蕾减数分裂进程通常领先于形态学下端位置的花蕾(附表S1)。统计结果同时表明，D、E、F位置花蕾减数分裂进程相对一致。如在96 h采样点，靠近花枝顶端在D、E、F位着生的花蕾小孢子母细胞减数分裂时期主要集中于双线期至终变期；而此时着生于A、B、C位置的花蕾小孢子母细胞减数分裂则较不同步，分别处于小孢子母细胞、细线期至粗线期、双线期至终变期等(附表S1)。这表明靠近花枝顶端D、E、F位置着生的花蕾，小孢子母细胞减数分裂进程通常领先并且同步性较好。

注：a:细线期；b:粗线期；c:双线期；d:终变期；e:中期Ⅰ；f:后期Ⅰ；g:末期Ⅰ；h:中期Ⅱ；i.后期Ⅱ；j.末期Ⅱ；k.四分体；l.小孢子。Note:a:Leptotene.b:Pachytene.c:Diplotene.d:Diakinesis.e:Metaphase Ⅰ.f:Anaphase Ⅰ.g:Telophase Ⅰ.h:Metaphase Ⅱ.i:Anaphase Ⅱ.j:Telophase Ⅱ.k:Tetrad.l:Microspore.图2 粗皮桉小孢子母细胞减数分裂进程(标尺=10 μm)Fig.2 Microsporogenesis in Eucalyptus pellita (Scale bar=10 μm)

2.3 粗皮桉不同位置花蕾直径大小发育规律

各采样时间点全部花蕾样本的直径测定结果表明(表2)，候选花枝上花蕾的直径随着花蕾发育时长增加而增大，并且花枝上不同着生位置花蕾的直径大小改变有所不同。自0 h采样开始至240 h采样结束，A位置花蕾平均直径增加最少，为0.28 mm，E、F位置花蕾平均直径增加均超过0.40 mm。同一时间点，花枝上不同着生位置花蕾的直径大小亦有所不同，方差分析结果显示，除0 h采样时间点外，其他采样时间点不同着生位置花蕾直径大小存在显著差异，处于形态学上端的花蕾平均直径大于形态学下端的花蕾，240 h采样点时，F位置比A位置花蕾平均直径大0.89 mm。多重比较结果显示，靠近花枝顶端的C至F位置着生的花蕾间直径无显著差异，但多与A、B位置着生花蕾直径大小存在显著差异。该结果从花蕾直径发育方面再次验证了位于花枝顶端位置着生的花蕾发育更加领先且一致性相对较高。

表2 花枝不同位置各采样时间花蕾直径发育Table 2 Flower buds diameter development at different positions at each sampling time /mm

2.4 秋水仙碱溶液处理诱导粗皮桉未减数2n花粉

根据开展诱变处理时间点和处理时长的不同，各目标花枝被分为若干处理组别，累计诱导处理花蕾2 758个。各处理组花蕾于散粉期进行细胞学观察用于确定诱变处理效果，结果显示，一些处理组别的花蕾内小孢子母细胞减数分裂发生改变，可在显微镜下观察到二分体以及大花粉出现(图3)，证实了秋水仙碱诱导未减数2n花粉的有效性；对照组花蕾中未发现二分体或大花粉，仅可见含有4个子细胞的正常四分体细胞。处理组观察到的二分体仅含2个子细胞，每个子细胞相较四分体子细胞更大，直径差异显著(t=17.77，P<0.01)。对照组小孢子为正四面体型，显微镜下投影平面呈三角形，可见明显萌发孔，平均直径为19.10 μm；而秋水仙碱处理后诱导获得的未减数2n花粉为球形，显微镜下投影平面为圆形，萌发孔不再清晰可辨，平均直径为24.71 μm，显著高于对照组普通单倍性花粉(t=19.49，P<0.01)。

自目标花枝上首次观察到有花蕾进入小孢子母细胞减数分裂细线期为起始，至240 h后减数分裂基本完成，期间以24 h为间隔划分为10个处理时间点，每个处理时间点分别设置3和6 h两种处理时长。各处理时间点和不同时长诱变处理的结果统计表明(表3)，经秋水仙碱处理后，各处理组花蕾数量均减少；未减数2n花粉的有效诱导率，受到处理时间点和处理时长的共同影响。在0和168 h及之后的时间点进行秋水仙碱处理均未获得2n花粉；而24～144 h进行秋水仙碱溶液处理，未减数2n花粉的有效诱导率先上升后下降，其中48 h时间点进行6 h处理时长的处理组未减数2n花粉有效诱导率最高，达到31.34%；成功诱导获得未减数2n花粉的处理组中，同一处理时间点，处理6 h的有效诱导率显著高于处理3 h(t=2.62，P<0.05)。

注：a:正常四分体；b:二分体；c:正常花粉；d:2n大花粉。Note:a:Normal tetrad.b:Dyad.c:Normal pollen.d:2n pollen.图3 粗皮桉小孢子母细胞减数分裂进程(标尺=10 μm)Fig.3 Microsporogenesis in Eucalyptus pellita (Scale bar=10 μm)

2.5 诱导粗皮桉2n花粉的最佳处理时机

实施秋水仙碱处理的同时，采集部分候选花枝靠近顶端着生的与处理组发育状态相同的若干花蕾，用于明确该处理试验点处理组花蕾所处的准确减数分裂时期，以探究诱导粗皮桉未减数2n花粉的最佳处理时机。统计结果显示(表4)，尽管采样观察对象为候选花枝顶端发育较为一致的花蕾，但各处理时间点除占比最高的主要减数分裂时期外，也存在多个相邻的减数分裂时期；随时间推移，不同处理时间点的花蕾小孢子母细胞减数分裂发生时期比例不断变化。如在48 h处理时间点，以小孢子母细胞减数分裂处于细线期至粗线期的花蕾为主，占比达到61.00%，远高于其他时期的花蕾数量。

基于每个处理时间点采集的样本花蕾所处减数分裂时期(表4)，以及各处理组未减数2n花粉有效诱导率(表3)，采用皮尔森相关分析确定秋水仙碱处理诱导未减数2n花粉产生的最佳处理时机。结果显示(图4)，目标花枝上小孢子母细胞减数分裂处于细线期至粗线期的粗皮桉花蕾占比，与未减数2n花粉有效诱导率之间呈显著正相关(r=0.937，P<0.01)；各处理组中，未减数2n花粉的有效诱导率随着处理对象中处于小孢子母细胞减数分裂细线期至粗线期的花蕾占比的增加而提高，在48 h处理时间点时，细线期至粗线期花蕾占比达到61.00%，此时2n花粉的有效诱导率最高，达到31.34%。这表明花蕾内小孢子母细胞发育至减数分裂细线期至粗线期时，是开展秋水仙碱处理诱导粗皮桉未减数2n花粉的最佳处理时机。

表3 秋水仙碱溶液处理诱导粗皮桉花粉染色体加倍的有效诱导率Table 3 Effective induction rate of pollen chromosome doubling treated with colchicine solution in Eucalyptus pellita

表4 粗皮桉花蕾发育时间与小孢子母细胞减数分裂时期对应关系Table 4 Relationship between development time and meiosis period of microsporocytes in Eucalyptus pellita

注：纵坐标为0.5%秋水仙碱溶液处理6 h后2n花粉有效诱导率，横坐标为对应时间小孢子母细胞减数分裂时期花蕾比例。Note:The ordinate is the effective induction rate of 2n pollens after 6 h treatment with 0.5% colchicine solution,and the abscissa is the proportion of flower buds in meiosis stages of microsporocytes at corresponding time.图4 2n花粉有效诱导率与小孢子母细胞减数分裂时期相关关系Fig.4 Correlation between effective pollen induction rate and meiosis stage of microsporocytes

3 讨论

研究小孢子母细胞减数分裂特征与进程是开展人工诱导未减数2n花粉的先决条件，原因在于物理或化学方法诱变产生2n花粉的原理，是在植物细胞减数分裂的特定敏感时期施加特定的诱变方法阻滞染色体的分离[28]。本研究中，粗皮桉花蕾内存在长花丝和短花丝两种雄蕊类型，两者间小孢子母细胞减数分裂进程存在明显差异，这种小孢子母细胞减数分裂的不同步性问题在多个树种中均有报道[32]。在桉树上，Davis[33]最早报道了密味桉(EucalyptusmelliodoraA.Cunn.)花蕾内部存在两种不同长度的雄蕊，即长花丝雄蕊和短花丝雄蕊。Yang等[31,34]曾分别对两种杂交桉花蕾发育进行观察研究，认为其花蕾内长花丝雄蕊小孢子母细胞减数分裂进程领先于短花丝雄蕊，与本研究的发现一致。这种小孢子母细胞减数分裂不同步的现象，被认为是植物适应环境的结果[35]，但也给染色体诱变育种工作中配子细胞减数分裂时期判别造成了影响。针对这种情况，本研究统一选择以花蕾内发育进度较为领先的长花丝雄蕊小孢子母细胞所处的减数分裂时期，判定为此刻该花蕾减数分裂的具体时期。

对花蕾发育研究发现，同一粗皮桉花枝不同着生位置的花蕾发育同样存在不同步性。这种花发育的不同步性并不罕见，在杨树[12]、杜仲[36]、橡胶[37]等树种的花粉发育研究中均有报道。在桉树上，有研究发现尾细桉杂种(Eucalyptusurophylla×E.tereticornis)位于花枝基部花蕾的直径发育和减数分裂进程均领先于枝条上部的花蕾，而尾巨桉杂种(Eucalyptusurophylla×E.grandis)则相反[31,34]。本研究中粗皮桉的花蕾发育模式与尾巨桉类似。花蕾发育的不同步性可能与花芽分化早晚及花蕾发育的成熟度有关。这种现象可以延长散粉期，对于桉树后代繁殖具有重要意义[35,38]，但同样给本研究中根据花蕾发育进程确定诱变对象造成了影响。本研究发现尽管总体上粗皮桉花枝不同位置着生花蕾的发育存在差异，但可以利用花枝上靠近顶端着生的D、E、F位置花蕾直径发育与减数分裂进程相对一致的特性，针对性地剔除难以辨别发育进程的花蕾，从而保留一致性较高、可以准确判定发育状态的目标花蕾，甄选诱变处理的对象。

基于以上结论，选择不同处理时间点开展秋水仙碱诱变处理，并在一些组中成功获得了粗皮桉未减数2n花粉。与单倍性花粉相比，诱导获得的2n花粉呈球形，直径较单倍性花粉显著增大。原因在于花粉的大小通常与其倍性水平总体呈正相关关系[39-42]。此外，已有研究证实桉树小孢子母细胞减数分裂仅发生一次胞质分裂，完成后产生四分体[31,34]。本研究在成功诱导获得2n花粉的处理组中，观察到大量二分体，表明秋水仙碱成功阻滞了细胞染色体的迁移。粗皮桉减数分裂后二分体的出现，以及形态、大小显著改变的2n大花粉的出现，是通过细胞学观察验证花粉染色体加倍结果的重要依据。

秋水仙碱处理诱导未减数2n配子，关键在于诱变时机和诱变强度的选择[26,28]。本研究发现对花蕾施加秋水仙碱处理的时机和时长不同，都会影响2n花粉的有效诱导率。在处理时机的选择上，本研究发现，在观察到小孢子母细胞进入减数分裂48 h后，即处于细线期至粗线期的花蕾占比最高时，施加诱变处理的有效诱导率最高，达到31.34%。这表明粗皮桉小孢子母细胞减数分裂细线期至粗线期是开展秋水仙碱溶液处理诱导未减数2n花粉的最佳处理时机。处理时机的选择与杨树[28，43]、杜仲[37]等树种的相关研究结果一致。但粗皮桉的2n花粉有效诱导率明显低于杜仲和杨树(约为49.5%～80.0%)。其原因在于桉树花蕾发育的一致性明显低于杜仲和杨树，使得一组有效的诱变处理无法确保目标花蕾内所有小孢子母细胞全部处于最佳处理时期。这种减数分裂高度不同步的特性是制约桉树配子染色体加倍诱导效率的关键。

除合适的处理时机外，不同的处理时长也会影响诱变处理的效果。本研究中，3和6 h时长的处理组均可获得未减数2n花粉，6 h处理组的有效诱导率更高。原因在于目标花蕾内小孢子母细胞的减数分裂进程是不同步的，并在诱变处理的同时持续进行，诱变处理时间的延长，可使一次诱变处理覆盖更多目标时期，从而提高有效诱导率。杨树采用多次注射秋水仙碱的方法延长处理时长以提高有效诱导率[25]。但多次注射的方法可能对花蕾造成更多的机械损伤，从而影响花粉产量[28]。本研究采用花枝一次性切口引入秋水仙碱的处理方式，可在增加处理时长的同时有效避免对花蕾造成机械伤害，有助于获得更多的诱变花粉。此外也要注意，秋水仙碱对植物细胞有一定毒害作用，处理时长应控制在一定范围内以降低对花蕾的伤害[44]。

4 结论

人工诱导未减数2n花粉是创制植物多倍体新品种的重要途径之一。本研究揭示了粗皮桉花蕾发育与小孢子母细胞减数分裂的时序性关系，建立了基于花蕾着生位置和发育时数，即时判别粗皮桉小孢子母细胞减数分裂时期的方法。即以花蕾内长花丝雄蕊小孢子母细胞减数分裂进入细线期开始，根据花蕾发育时长与小孢子母细胞减数分裂时序关系判断花蕾所处的具体减数分裂时期。同时，本研究明确了采用秋水仙碱溶液处理诱导粗皮桉花粉染色体加倍的最佳时机和最佳处理强度。待观察到小孢子母细胞减数分裂开始后48 h，即多数花蕾处于细线期至粗线期时，在靠近花序位置的花枝上切口并导入0.5%浓度秋水仙碱溶液，处理花蕾6 h效果最佳。本研究结果为进一步开展桉树多倍体种质创新工作提供了理论论据。

附表S1 各采样时间点处于小孢子母细胞减数分裂不同时期的花蕾占比Table S1 The proportion of buds in different meiosis stages of microsporocytes at different sampling time point

续附表

续附表